蛋白质异戊烯化对植物中K63连接多聚泛素化的作用研究

Ubiquitination is a means of post-translational modification that plays an important role in eukaryotic cellular processes and response to environmental stresses. Differing from the conventional K48-linked polyubiquitination that targets protein for degradation, K63-linked polyubiquitination is believed to alter the target protein activity, and this process requires a Ubc13-Uev heterodimer as a E2. Most multicellular eukaryotic organisms contain one UBC13 gene but multiple UEV genes, suggesting that Uev is a regulatory subunit of the above process. My laboratory reported initial isolation and functional characterization of UBC13-UEV genes from yeast and mammalian cells, and recently reported the similar studies in plants. More recently, we found that a subgroup UEV genes from plants contain a consensus C-terminal motif indicative of lipid modifications known as prenylation, which often makes modified proteins membrane-bound or alters protein-protein interaction. In this project, we will investigate how plant Uev protein prenylation is involved in the regulation of the Ubc13-Uev activity, and to search for their cognate E3s and substrates. Since we recently found that plants lacking Ubc13 display multiple developmental and stress response defects, we anticipate that this proposed study will help us to understand how two protein modifications interplay in the regulation of important plant bioprocesses such as hormone signaling and innate immunity.

泛素化是一种重要的翻译后修饰方式,这种修饰参与真核细胞的多种途径以及环境胁迫应答.与传统的K48连接多聚泛素化介导蛋白降解的方式不同,K63连接多聚泛素化参与调控蛋白质活性,而这一过程需要Ubc13-Uev异源二聚体作为E2.多数多细胞生物中含有一个UBC13但却有多个UEV基因,暗示着Uev在上述过程中充当调节亚基.我们实验室首先报道了酵母、哺乳动物和植物细胞中的UBC13和Uev基因.我们最近发现一些植物的UEV基因含有一个C端异戊烯修饰基序,这一基序通常参与蛋白质膜锚定或者调节蛋白间相互作用.本项目中,我们将就Uev蛋白异戊烯化如何参与调节Ubc13-Uev活性进行研究,并寻找相应的E3以及底物.因为我们最近发现植物Ubc13缺失会展现出多种发育以及胁迫应答缺陷,我们期待这一项目可以解答泛素化和异戊烯化两种不同的蛋白修饰方式是如何相互作用并参与到诸如激素信号及自然免疫等植物生理过程.

在真核生物中，蛋白质的活性以及功能的执行可以被其翻译后修饰所调控。泛素化作为其中重要的修饰类型已受到广泛地关注，除了常规的通过Lys48（K48）连接的多聚泛素化介导底物蛋白的降解之外，通过Lys63（K63）连接的非常规多聚泛素化也日益受到研究人员的重视。K63泛素化的底物已被证实能够参与DNA损伤耐受、NF-κB信号通路、内吞等重要途径当中，而对于植物中K63连接的泛素化修饰的功能与底物的研究还相对匮乏。. 目前，唯一已被证实的能够催化K63多聚泛素链形成的泛素结合酶E2为Ubc13，该E2不能单独行使K63多聚泛素链催化功能，必须借由Ubc变体——Uev的辅助。本课题以Ubc13-Uev E2复合体作为研究对象，通过对二穗短柄草（Bd）中的UBC13和UEV1s的分离鉴定及功能分析，证明了其进化上与拟南芥（At）相应同源基因的保守性，并且能够参与DNA损伤耐受途径。研究结果还表明，相对于Ubc13在各物种中的高度保守与稳定表达来看，Uev1s的表达在时间与空间上均存在差异，这暗示着不同的Uev1s可能是作为参与不同信号途径的调节者而发挥功能的。. 通过对植物中Uev1s的序列比对，将其分为两类：一类与AtUev1A/1B相似度较高，在其C末端多出的18个氨基酸中存在异戊烯化修饰的靶位点Cys；另一类与AtUev1C/1D相似度较高，其C末端不存在可被异戊烯化修饰的潜在位点。细胞生物学与生化实验表明：异戊烯化修饰位点的存在影响了AtUEV1A/1B参与DNA损伤耐受的功能，介导了它们与其它蛋白质之间的相互作用，增加了其在膜系统上的分布水平。经过对AtUev1A/1B双突变植株的表型分析，初步确定其在内质网压力响应中发挥作用，双突变植株对内质网压力较野生型不敏感，并且该表型与AtUev1A/1B能否被的异戊烯化有关。其作用机制可能通过调节下游相关转录因子NAC089的入核行为来进行调控。. 综上所述，本课题通过探讨模式植物中Ubc13和Uev的功能，为进一步研究植物中K63多聚泛素化的功能奠定了基础；同时也有助于更好地理解多种不同的蛋白质翻译后修饰是如何协同运作的。