K63连接多聚泛素修饰在BRCA1依赖的DNA损伤修复中的作用

BRCA1 is a key tumor suppressor which plays central roles in the suppression of breast and ovarian cancer. Clinical mutations of BRCA1 strongly predispose women to breast and ovarian cancer. Upon DNA damage, BRCA1 is promptly recruited to the site of DNA damage, where it participates and mediates homologous recombination repair ofDNA double strand-breaks (DSBs). The process of BRCA1 recruitment requires molecular recognition of K63-linked polyubiquitin chains (K63-Ub) at the site of DSBs. As an important type of protein modification, K63-linked polyubiquitination can mediate protein-protein interaction, playing critical roles in BRCA1-dependent,homologous recombinationdirected repair. The process and molecular basis on how K63-linked polyubiquitination is regulated at DSBs and its role in BRCA1-dependent DNA damage repair and tumor suppression are largely undefined. This proposal will aim to isolate and characterize these K63-Ub polyubiquitinated proteins that are associated with DNA damage repair, and to disclose the biochemical pathways for the synthesis as well as hydrolysis of K63-Ub at sites of DSBs. Moreover, siRNA or shRNA-based knockdown cell lines will be generated to investigate the possible correlation between the levels of K63-linked polyubiquitination and BRCA1-dependent homologous recombination in the suppression of breast cancer. This study will provide novel insights into BRCA1 biology and the mechanism underlying its tumor suppression。 It will also promote the identification of breast cancer susceptible genes,and have implications in the screening, diagnosis and treatment of breast cancer as well as in the development of anti-tumor drugs.

BRCA1是一个重要的抑癌基因，在抑制乳腺癌的发生中起重要作用。BRCA1突变个体对乳腺癌和卵巢癌高度易感。当细胞DNA受到损伤时，BRCA1可以迅速被靶向募集到损伤部位，参与对DNA双链断裂（DSBs）的修复。BRCA1对DSBs的识别和募集依赖于DSBs处的K63连接的多聚泛素化链（K63Ub）。K63Ub修饰是一种重要的蛋白质修饰方式，可介导蛋白分子间的相互作用，在BRCA1介导的同源重组修复中发挥重要作用，但是目前对于它是如何调控和影响BRCA1的功能及其抑癌机理并不清楚。本研究拟分离和鉴定DNA损伤相关的K63Ub修饰蛋白，揭示DSBs部位K63Ub合成和降解的生化途径，运用基因敲低细胞模型，阐明K63Ub水平与BRCA1功能之间的关系。此研究对于分离新的乳腺癌易感基因,解析BRCA1抑癌网络组成和抑癌机理、以及乳腺癌的防治和抗癌药物研发等都具有重要意义。

细胞时刻面临DNA损伤，当DNA损伤发生时，许多重要的修复分子如BRCA1和RNF8等可以迅速被靶向募集到损伤部位，参与对DNA损伤的修复，以保证基因组的稳定性。DNA损伤修复分子对DNA损伤部位的识别和募集依赖于K63连接的多聚泛素化链（K63Ub）。K63Ub修饰是一种重要的蛋白质修饰方式，可介导蛋白分子间的相互作用，在DNA损伤修复如BRCA1介导的同源重组中发挥重要作用。RNF8是合成K63Ub的一个主要E3连接酶，在DNA损伤修复中发挥重要作用。但是目前对于它调控和影响DNA损伤修复功能的机制并不清楚。本项目通过蛋白质层析、质谱等方法，分离和鉴定了RNF8的一系列酶学底物，验证了它们的K63Ub修饰，探索RNF8和这些底物泛素化调控在DNA 损伤修复中的作用和机制。研究还进一步运用细胞和小鼠模型，探索了RNF8调控底物的K63Ub水平与肿瘤发生和转移中的作用。研究最后还探索了RNF8参与的K63Ub调控在DNA损伤修复、细胞生长、存活和耐药等作用机制。研究发现，RNF8是一个重要的肿瘤相关分子，参与细胞EMT，在乳腺癌的转移和耐药中发挥重要作用。研究分离并证实AKT是RNF8的一个重要底物，可以被RNF8以K63Ub形式修饰，从而进一步磷酸化而活化。活化的AKT可以被靶向定位到细胞膜或DNA损伤部位，从而促进细胞存活和增殖，或参与DNA损伤修复和吉非替尼等肺癌靶向药物抵抗。更为重要的是，研究发现抗癌药物Doxorubicin, cisplatin等可以激活AKT,而其激活机制依赖于RNF8介导的K63Ub修饰。这个研究揭示了RNF8参与DNA损伤导致的AKT激活的分子机制及其信号通路，阐明了RNF8参与抗癌耐药和放化疗抵抗的作用和分子机制。本项目研究揭示了RNF8的K63Ub修饰的底物及其参与DNA损伤中的作用机制，发现AKT是RNF8介导肿瘤发生、转移和耐药及放化疗抵抗的关键底物。该发现阐明了肿瘤细胞耐药和放化疗抵抗的一个重要机制，为抗肿瘤药物研发和肿瘤靶向治疗提供了一个新的靶标。