乙型肝炎病毒x蛋白激活Rho信号途径诱发肝细胞恶性转化分子机制的定量蛋白质组学研究

HBx gene, one ORF of hepatitis b virus, was closely related to multiple important biological function of host cells, including the transcriptional activation andcell cycle regulation. We found that HBx induced the malignant transformation of hepatocytes through the activation of CDC42 signaling pathway by the large scale quantitative proteomics study with SILAC labeled mice and theHBx transgenic mice. However, the mechanism of the activation of CDC42 signaling pathway during the occurance and development of liver disease induced by HBx remains study. We propose to apply quantitative proteomics study to reveal the CDC42 signal from the regulation of protein interaction and gene network in HBx inducedmalignant transformation process under the gene knockout or overexpression of CDC42 in HBx transfected cells. The study will also enhance the understanding of the mechanism of action of HBV.

作为乙型病毒性肝炎开放读码框之一的HBx基因与宿主细胞转录激活、细胞周期调控等许多重要生命活动密切相关。本申请建立在申请人前期对HBx转基因小鼠定量蛋白组学研究发现HBx引发肝细胞恶性转化与激活CDC42信号通路关系密切的基础之上，设计采用在基因敲除或过表达CDC42基因、SILAC正反标记细胞结合蛋白组学技术，同时采用靶向蛋白组学与定量蛋白组学结合的方法研究CDC42基因功能，旨在从蛋白质相互作用和基因网络调控的角度更准确地揭示CDC42信号激活在HBx介导肝细胞恶性转化进程中的作用机制，同时也将加深对HBV作用机制的理解。

我们前期研究发现在HBx诱发小鼠肝脏由重度炎症转变为癌症过程中CDC42信号通路被激活。定量PCR确证在Huh7-HBx细胞中存在HBx基因的异常表达。利用CCK-8实验发现Huh7-HBx细胞的增殖能力显著升高；利用流式细胞仪发现Huh7-HBx细胞的抗凋亡能力显著升高；利用细胞划痕实验发现Huh7-HBx细胞的迁移能力显著升高，表明稳定转染HBx的细胞癌细胞的特性增强。稳定转染HBx基因细胞内CDC42蛋白表达水平提高，提示CDC42蛋白在HBx诱发的Huh7细胞恶性转化中发挥作用。利用CRISPR/Cas9技术成功获得在靶位点处发生4个碱基缺失的突变体；Western Blot检测确证获得Huh7-HBx CDC42 KO细胞系，发现Huh7-HBx CDC42 KO细胞的增殖能力显著减低；利用流式细胞仪检测细胞的抗凋亡能力，发现Huh7-HBx CDC42 KO细胞的抗凋亡能力显著降低；利用细胞划痕实验检测细胞的迁移能力，发现Huh7-HBx CDC42 KO细胞的迁移能力显著降低，表明CDC42蛋白的缺失减弱了HBx介导的Huh7细胞的恶性转化。利用CDC42特异性抑制剂CASIN分别处理Huh7细胞和Huh7-HBx细胞一定时间后，检测其细胞增殖能力和细胞抗凋亡能力，发现HBx介导的Huh7细胞恶性转化需要CDC42蛋白的活化。利用准等重二甲基标记的定量蛋白质组学技术，鉴定523个差异蛋白，下调蛋白和上调蛋白数目分别为283和240。对283个下调蛋白进行功能分析（Gene Ontology，GO），发现这些蛋白的功能主要聚集在细胞死亡调控、细胞凋亡调控等生物进程。因此，推测CDC42蛋白通过调控细胞的增殖和凋亡参与了HBx介导的Huh7细胞的恶性转化。在这283个差异蛋白中， CDC42蛋白的效应因子蛋白IQGAP1表达量明显下调。综上，HBx进入Huh7细胞后，通过调控CDC42蛋白的上游调节因子，进而改变CDC42的活性，使其与IQGAP1结合，影响Huh7细胞的细胞分裂、增殖等生命活动，最终导致了Huh7细胞恶性化程度的升高。HBx/CDC42/IQGAP1信号通路在HBx诱发肝细胞恶性转化中具有重要作用，可能是HBV致癌的一种新机制。