ACSL4调控V-ATPase对脊髓损伤后神经元铁死亡的作用及机制研究

The cascade of neuronal death is an important reason for the progressive loss of nerve function caused by spinal cord injury. Ferroptosis is a newly characterized form of cell death, which relies on iron aggregation and oxidative damage, and is becoming a hot topic in medical research. Our previously published and unpublished data proved that: 1) ferroptosis is involved in the neuronal death after spinal cord injury; 2) ACSL4 is highly expressed in neurons after spinal cord injury, and is the key regulator of ferroptosis. The applicant further put forward the hypothesis that ACSL4 can promote release of iron from lysosomes and oxidative damage and eventually lead to the neuronal death by regulating V-ATPase activity. According to the above hypothesis, this project intends to use animal spinal cord injury model and neuronal cells as the main material, using gene silencing and overexpression and other research methods, on the molecular, cell and whole-body level, to systematically explore the molecular mechanism of ACSL4 regulating V-ATPase activity and lysosomal iron metabolism, and to explore pharmaceutical intervention in the signaling pathway of ferroptosis for the treatment of spinal cord injury,and has the theoretical significance and potential application value.

神经元级联式死亡是脊髓损伤所致神经功能进行性缺失的重要原因。铁死亡是一种依赖于铁聚集和氧化损伤的死亡新模式，正成为医学研究热点。项目组前期发表和未发表的工作证明:1）铁死亡参与脊髓损伤神经元的死亡;2）ACSL4在脊髓损伤神经元中高表达，是铁死亡的关键脂代谢酶。申请者进一步提出“ACSL4通过调控V-ATPase活性，从而促进溶酶体铁释放和氧化损伤，最终导致神经元铁死亡”的科学假说。针对上述假说，本项目拟选用脊髓损伤动物和神经元细胞为主要研究材料，采用基因沉默和过表达等研究手段，在分子、细胞和整体水平，系统探讨铁死亡中ACSL4调控V-ATPase活性和溶酶体铁代谢的分子机制，并探索药物干预铁死亡信号通路防治脊髓损伤的手段，具有重要理论意义和潜在应用价值。

铁死亡是一种依赖于铁聚集和氧化损伤的死亡新模式。多项研究表明铁死亡在SCI后继发性损伤的病理过程中起重要作用。然而，SCI中铁死亡的病理生理学作用和相关机制仍然知之甚少。我们之前的研究发现，1）铁死亡参与脊髓损伤神经元的死亡；2）ACSL4在脊髓损伤神经元中高表达，是铁死亡的关键脂代谢酶。本课题通过构建稳转ACSL4的HT22细胞株，我们发现ACSL4过表达对HT22铁死亡过程中总铁的变化没有显著的影响，但增加了HT22铁死亡过程中ROS、MDA、二价铁的量，降低了神经元铁死亡中GSH的水平，促进了HT22的铁死亡，说明ACSL4 对神经元铁死亡的敏感性有重要影响。通过bafA1抑制V-ATP酶的活性，我们发现V-ATPase 的抑制，提高了细胞溶酶体的 PH 值， 减少了细胞Fe2+的量，并抑制了铁死亡，说明V-ATPase通过影响细胞Fe2+来促进铁死亡是神经元铁死亡的重要调控机制。与之前假说不同的是，V-ATP酶的活性的抑制并没有降低LMP，反而升高了LMP。说明V-ATP酶并不是通过影响LMP影响细胞Fe2+的变化。通过ACSL4的RNAi和药物抑制实验，发现ACSL4的表达与V-ATP酶的v1A亚基密切相关，并影响铁死亡过程中V-ATPase的功能，最终影响铁死亡过程中细胞Fe2+的变化，而铁死亡过程中ACSL4高表达引起的V-ATP酶功能和细胞内Fe2+变化可以被V-ATP酶抑制剂bafA1阻断。说明ACSL4通过V-ATPase 影响溶酶体功能，进而改变细胞内Fe2+决定了神经元铁死亡的敏感性。通过小鼠脊髓损伤模型，我们观察到铁死亡特异性抑制剂Fer-1的应用，可以促进脊髓损伤后神经元的存活，进而促进脊髓损伤小鼠运动功能的恢复，提示抑制铁死亡能够促进脊髓损伤后神经元的存活，进而促进脊髓损伤后运动功能的恢复。而ACSL4特异性抑制剂TRO的应用可以下调损伤脊髓的V-ATP酶的v1A亚基的表达，促进脊髓损伤后神经元的存活，最终促进脊髓损伤小鼠运动功能的恢复。上述结果揭示了ACSL4通过V-ATPase调控细胞内Fe2+从而决定脊髓损伤后神经元铁死亡敏感性的分子机制，为进一步揭示脊髓损伤后神经元的死亡机制提供新的理论基础，为临床脊髓损伤的治疗提供新的靶点和思路。