调控自噬对机械损伤脊髓神经元凋亡的作用及机制研究

Autophagy, as the process of self degradation in lysosome dependent cells, can mostly overcome distress and act as a protector. Recent studies indicated that the activation of autophagy may have some beneficial effect at the early stage of central nervous system injury. Apoptosis is the main mechanism of secondary spinal cord injury (SCI). Our previous studies revealed that during the process of cell death in nerve cell autophagy occurred prior to apoptosis, and that intraperitoneal injection of rapamycin can effectively inhibit nerve cell apoptosis and improve motor function, but its mechanism remains unclear. This project will use the mechanical injury model of original spinal neurons to further investigate the effect of autophagy on apoptosis of neurons and its possible mechanism. We will first use Rapamicin or 3-MA to control autophagy and observe the correlation between autophagy, apoptosis and cell viability. Then we'll transfect beclin-1 to the neuron or restrain the expression of beclin-1 by micro RNA technique, in order to study the relation of apoptosis and the autophagic differentiation controlled by beclin-1, and study the protective effect of autophagy on cells. At last we will investigate the possible molecular mechanisms of autophagy's effect on apoptosis via mitochondrial pathway. By this study, we aim to find a new target from the angle of autophagy for the research and development of drugs to treat SCI

自噬作为溶酶体依赖的细胞自我降解过程，在多数情况下可使细胞克服不良应激起保护作用。近来研究提示自噬的激活可能在中枢神经系统损伤早期对神经细胞起一定的保护作用。凋亡是引起继发性脊髓损伤的主要机制。我们在前期研究中已经证实脊髓损伤后自噬激活且先于凋亡发生，给予自噬激活剂Rapamicin能够减少神经细胞的凋亡，改善运动功能，但两者的关系还不明确。本项目拟应用原代脊髓神经元机械损伤模型深入探讨损伤后自噬对神经元凋亡的影响及可能机制。 首先应用Rapamicin或3-MA调控自噬，观察自噬与凋亡及细胞活力的相关性；其次通过向神经元转染beclin 1 或运用microRNA技术抑制beclin1的表达，研究调控beclin1介导的自噬变化与凋亡的关系，并探讨自噬的细胞保护作用；最后探讨自噬通过线粒体途径影响凋亡的可能分子机制。通过以上研究，以期从自噬调控的角度为研发SCI治疗药物提供新的靶标。

自噬作为溶酶体依赖的细胞自我降解过程，在多数情况下可使细胞克服不良应激起保护作用。近来研究提示自噬的激活可能在中枢神经系统损伤早期对神经细胞起一定的保护作用。凋亡是引起继发性脊髓损伤的主要机制。我们使用体外SCI模型来观察自噬和细胞凋亡的时间依赖性诱导。为了阐明自噬对细胞凋亡的影响，将机械损伤的神经元分别用已知分别调节自噬的mTOR抑制剂雷帕霉素和3-甲基腺嘌呤（3-MA）处理。雷帕霉素处理的神经元表现出最高水平的细胞活力和最低水平的细胞凋亡的损伤神经元和3-MA处理显示相互作用。雷帕霉素处理的神经元表现出Bax表达的轻微降低和显着增加的Bcl-2表达。此外，通过质粒转染，我们显示与载体对照相比，Beclin-1过表达神经元细胞对机械损伤有响应，LC3II / LC3I转换和细胞存活力更高，凋亡水平更低，Bcl-2表达更高，Bax表达更高细胞。 Beclin-1-knockdown神经元显示几乎相反的效果。进一步的研究发现Akt和mTOR磷酸化水平在机械损伤后4小时达到峰值，然后下降。在施用PI3K特异性抑制剂LY294002后，下游分子中Akt和mTOR的磷酸化水平降低。同时，自噬特异性蛋白微管相关蛋白1轻链（LC3）II / I的比例高于单纯损伤组。采用TUNEL法检测细胞凋亡水平，结果显示PI3K / Akt / mTOR信号通路抑制后细胞凋亡水平明显降低。综上所述，自噬可以作为机械损伤的脊髓神经元中的细胞凋亡的保护。靶向mTOR和/或增强Beclin-1表达可能是SCI的替代治疗策略。PI3K / Akt / mTOR信号通路参与机械性损伤后神经元的凋亡，可通过线粒体途径诱导细胞凋亡。