非酒精性脂肪肝增量表达CYP2A5的作用机制及其发病机制

在前一个项目基础上，本项目将继续以CYP2A5作为人CYP2A6的模型，以前期建立的非酒精性脂肪肝模型C57B1/6鼠为试验动物，采用基因芯片等分子生物学手段分析非酒精性脂肪肝病鼠与健康鼠肝脏基因的表达谱，采用Real-Time PCR方法验证差异基因，分析差异基因功能及非酒精性脂肪肝损伤时刺激CYP2A5增量表达的刺激因子。采用Nrf2基因缺失鼠诱导非酒精性脂肪肝，分析CYP2A5的增量表达是否依赖Nrf2通路，并研究Nrf2基因缺失对非酒精性脂肪肝病理生理进程影响及其作用的分子机制。阐明Nrf2通路在肝损伤时增量调节CYP2A5中的作用，明确CYP2A5是否是Nrf2的靶基因；探讨非酒精脂肪肝损伤、Nrf2和CYP2A5之间的相互作用，为全面认识非酒精性脂肪肝的发病机制以及CYP2A5/CYP2A6的变化规律奠定基础，也为筛选新的药物靶标、预防吸烟相关疾病及各种肝脏疾病防治提供新思路。

前期试验结果表明，小鼠饲喂高脂饲料发生非酒精性脂肪肝（NAFLD）时肝细胞CYP2A5表达量显著增高，其它大多数Ⅰ相酶表达量是降低的；文献报道，化学性肝损伤（苯、吡唑等药物）、毒素性肝损伤（黄曲霉毒素B1等）、重金属性肝损伤（钴、铬等）等病理条件下CYP2A5的表达量也是升高的，这些刺激因子在化学结构上是互不相关的，显然CYP2a5的升高与刺激因子的化学结构无关。我们推论可能与药物或者高脂诱导的肝脏毒性或者病理变化相关；另外一个重要发现是伴随CYP2A5的升高，Nrf2的表达量也发生了显著变化。Nrf2是细胞防御氧化应激的重要调节因子，我们假设NAFLD病理条件下CYP2A5的增量表达与高脂诱导的氧化应激或病理变化激活Nrf2的表达相关，如果使Nrf2基因缺失，对高脂饲料诱导小鼠发生NAFLD时CYP2A5的表达量有何影响？对非酒精性脂肪肝疾病的发生发展有何影响，这方面的研究国内外均未见报道。因此，在前期研究基础上，本项目以野生型和Nrf2缺失型ICR鼠为试验动物，采用前期建立的方法复制非酒精性脂肪肝模型；采用Real-Time PCR、Western blot、免疫共沉淀等分子生物学技术研究NAFLD时CYP2A5 的增量表达是否依赖Nrf2 通路，并从器官、细胞、分子等不同层次研究Nrf2基因缺失对非酒精性脂肪肝病理进程的影响及其作用的分子机制。探讨非酒精脂肪肝损伤、Nrf2 和CYP2A5 之间的相互作用。研究结果表明NAFLD疾病的发生发展与高脂饲料诱导的肝脏氧化应激密切相关，敲除Nrf2基因会减少高脂诱导的NAFLD中参与抗氧化应激的因子数量，加快NAFLD的发生、加重NAFLD的发生发展进程，其中降低脂质代谢相关基因、抗炎症因子以及氧化应激因子的表达量是Nrf2缺失导致促进或加重高脂诱导的NAFLD疾病进程的主要分子作用机制；器官、细胞、分子水平的研究结果是一致的。通过这些数据我们认为Nfr2有可能成为治疗非酒精性脂肪肝的一个潜在作用靶点，这是本项目研究的一个重大发现；本项目的另外一个重大发现是，高脂诱导的NAFLD过程中CYP2A5表达量的升高与Nrf2的调控相关，Cyp2a5有可能成为肝损伤的潜在生物学标记物之一，研究结果为全面认识非酒精性脂肪肝的发病机制及筛选新的药物靶标和有效防治非酒精性脂肪肝等肝脏疾病提供了新思路。