食品中VBNC状态大肠杆菌O157:H7复活的分子机制研究

In recent years, research on Viable but nonculturable state （VBNC）of Escherichia coli 0157:H7 has been highlighted since VBNC bacteria can be resuscitated from dormancy in appropriate conditions leading to food safety issues. However the detection and control technology of the VBNC bacteria is still immature mainly because the mechanism of the resurrection process remains unclear. This research intends to demonstrate the protein expression diversity between the VBNC and normal bacteria during the various phases of the resurrection process, and find out the functional genes by protein identify and functional analysis. The crucial genes will be further analyzed by "gene deletion" to verify the restoration function and the expression regulation relationships of these genes will also be demonstrated for deep understanding the relevance among "protein- gene- CDS- function". This research will finally improve the understanding of molecular mechanism behind phenotypic changes in culturability restoration of VBNC E. coli 0157:H7,which can become a good basis for the determination and control of VBNC bacteria in food.

活的非可培养状态（VBNC）的大肠杆菌O157:H7在条件合适时能复活，从而恢复致病性，形成潜在重大的食品安全隐患，已引起研究者高度重视，成为近年来的研究热点。然而学术界对其复活的分子机制并不清楚，导致对该菌的VBNC状态检测和控制处于技术空白。本项目研究该菌在VBNC状态下，通过诱导复活过程中，不同阶段 VBNC菌与正常菌蛋白表达谱的差异，对特征蛋白进行功能鉴定与分析后，定位到相关功能基因，通过基因敲除，进一步确认这些功能基因在VBNC状态复活中的地位与作用，探明重要关键基因的定位与功能，尤其是关键基因之间组成的基因表达传递调控链脉络，揭示"蛋白（谱）-基因（谱）-CDS（群）-功能"的内在关系。在以上研究工作的基础上，最终阐明VBNC状态大肠杆菌O157:H7复活的分子机制，为食品中VBNC状态病原菌的检测与控制打下重要的理论基础，对其它VBNC状态病原菌的研究有很好的借鉴作用。

本项目在研究过程中，采用低温、低pH或者寡营养等因素胁迫来诱导肠出血性大肠杆菌O157:H7 的VBNC状态。采用升温复苏添加适当的营养物质成功在2天内将VBNC状态肠出血性复苏，可培养菌数到达接近于诱导前浓度，复苏后菌株与正常菌株形态类似。结合平板计数法、荧光显微镜观察法和荧光定量PCR技术对VBNC菌进行有效、快速、准确地检测。通过转录组学技术，筛选VBNC菌与正常菌基因所对应的mRNA表达差异，定位到相关功能基因，对特征蛋白进行GO和KEGG等功能分析，在诱导VBNC菌的复活过程中，结合基因敲除实验辅助验证，初步明确了VBNC状态大肠杆菌O157：H7复活的分子机制。总体上来说，细胞通过降低糖类以及蛋白等代谢维持细胞处于极低营养需求状态；同时提高蛋白合成时翻译的精确性，通过分子伴侶蛋白促进蛋白的正确折叠等；另外，通过提高细胞中Fe-S系统、过氧物酶体和ROS清除剂等的活性，提高细胞应对不利环境的能力。通过基因敲除手段对关键基因及其在VBNC状态复活中的功能进行了检验。初步推测，作为调控因子的rpoS和过氧化物还原酶体系中ahpC在极酸性条件下，保护肠出血性大肠杆菌长期处于VBNC状态，通过提高过氧物酶体代谢、核黄素代谢以及ROS清除剂来抵抗不利环境，协助细胞度过VBNC状态，完成复活过程。