速冻食品中VBNC状态大肠杆菌O157:H7形成的分子机制研究

Escherichia coli O157:H7 could enter into the viable but nonculturable (VBNC) state induced at low temperature in quick-frozen food. It may be able to recovery under certain conditions, thereby retain its pathogenicity and play a potential threat to food safety. However, the molecular mechanism of E. coli O157:H7 VBNC formation still is not clear, lack of systematic research. In this project the transcriptional profiles and protein expression profiles of E. coli O157:H7 are studied by comprehensive transcriptomics, proteomics and bioinformatics methods, to reveal the cellula materials and metabolic characteristics. With the comparative transcriptome and proteome analyses, the specific genes in regulation of the VBNC state formation are selected. The mutants are constructed and studied the the biological characteristics and pathogenicity in normal and VBNC state. Real-time RT-PCR is used to detect the expression levels of the specific genes during induced by the room temperature, to further investigate the relationship of the specific genes and E. coli O157:H7 viability. Based on the above work, the aim is to clarify finally the molecular mechanism of E. coli O157:H7 VBNC formation, to provide a theoretical basis for the existence and occurrence of pathogenic mechanisms in quick-frozen food.

速冻食品中大肠杆菌O157:H7在低温诱导下可进入活的不可培养状态（Viable But Nonculturable State,VBNC)，在适当条件下可能复苏，从而恢复致病性，成为食品安全的潜在威胁。目前对其VBNC形成的分子机制并不清楚，缺乏系统性研究。本项目拟综合运用转录组学、蛋白组学和生物信息学的手段，构建差异表达谱，解析状态转变中的细胞物质基础及代谢特征；通过转录组和蛋白质组比较关联分析，筛选调控VBNC状态形成的特异性基因，构建特异性基因的缺失突变株，研究突变株在正常状态和VBNC状态时的生物学特性和致病性；利用反转录实时荧光定量PCR研究在低温下诱导培养不同时段这些基因的转录特征，进一步研究其生存能力与特异性基因表达的关系。在以上工作基础上，最终阐明VBNC状态大肠杆菌O157:H7形成的分子机制，为速冻食品中大肠杆菌O157:H7的生存和致病的发生机制提供理论依据。

食源性大肠杆菌O157:H7在低温诱导下可进入VBNC状态，在适当条件下可能复苏，从而恢复致病性，成为食品安全的潜在威胁。目前对其VBNC形成的分子机制并不清楚，缺乏系统性的研究。.1)本课题分别在-20℃和4℃建立速冻牛肉丸低温诱导体系，通过涂布平板计数法在-20℃诱导152 天后确认速冻牛肉丸中E. coli O157:H7进入不可培养状态，同时采用萘啶酮酸活菌直接计数法验证了不可培养状态的E. coli O157:H7为活菌状态，并测得活菌数即VBNC菌数为6.3×107 cells/mL，但是4℃速冻牛肉丸中E. coli O157:H7无法进入VBNC状态，其可培养数在诱导第156天依然保持在108 CFU/mL；.2) 采用转录组学方法对低温诱导进入VBNC状态的E. coli O157:H7与正常对数生长期细胞进行转录组测序与分析，得到两者间显著的差异表达基因，通过GO功能分析对实验中得到差异表达基因进行注释及其功能的预测，再通过KEGG Pathway分析对实验中得到差异表达基因进行代谢途径的分析预测，从而推测出在低温诱导条件下进入VBNC状态的E. coli O157:H7中存在的相关分子机制。KEGG Pathway分析结果在转录水平层面上说明了在-20oC诱导进入VBNC状态的胞内蛋白质合成不但没有停止，反而合成了相当数量的蛋白质来维持VBNC状态的机能代谢过程和生命活动，而VBNC细胞的形成与这些蛋白质的合成密切相关。.3)探究了E.coli O157:H7野生株与基因缺陷株进入VBNC状态的差异。结合AODC法、DVC法和平板计数法观察VBNC诱导过程中细菌的变化发现，在-20℃富营养诱导条件下E.coli O157:H7-∆rpoS缺陷株18天便完全进入VBNC状态，与野生株和其他缺陷株相比，其诱导进入VNBC状态时间缩短了一半；研究了E.coli O157:H7野生株与基因缺陷株在生物学特性的差异。研究发现，传代10次的基因缺陷株与初代基因缺陷株相比没有遗传水平上的差异；fimC基因缺失会造成E.coli O157:H7菌株运动性降低；rpoS基因缺失使E.coli O157:H7应对酸胁迫的能力严重降低；与野生型E.coli O157:H7相比，fimC和luxS基因缺失在一定程度上影响细菌生物被膜的形成。