高压二氧化碳诱导Escherichia coli O157:H7形成VBNC状态的机制

Escherichia coli O157:H7, a foodborne pathogen, can enter into a viable but nonculturable (VBNC) state in some adverse conditions. Although VBNC cells remain viable, they cannot grow in or develop colonies on nonselective media normally used for their culture, which make the VBNC cells undetectable by traditional culture methods. Therefore, VBNC cells in food systems would increase the risk of food safety. High pressure carbon dioxide (HPCD), one of the most promising non-thermal processing techniques, can kill microorganisms in food and retain food quality by the effects of pressurization, acidification, explosion, anaerobic environment and super/sub-critical conditions. However, we reported for the first time that HPCD could induce bacteria in apple juice to form the VBNC state, and then found that E. coli O157:H7 (non-toxogenic strain) could also enter into VBNC state by HPCD treatment. The discovery makes HPCD technique meet challenges in food processing. In order to optimize HPCD processing strategy and ensure food safety, this research aimed to investigate the best HPCD parameter for the induction of E. coli O157:H7 into VBNC state, and analyze the morphological characteristics and physiological property of VBNC cells by scanning electron microscope (SEM), transmission electron microscope (TEM), fluorophotometer and API ZYM kit. This research has significant value for theory and practice.

Escherichia coli O157:H7是一种食源性致病菌，在某些逆境条件下可进入一种活的但非可培养（viable but nonculturable, VBNC）状态，该状态细菌用常规培养方法检测不到，从而对食品安全构成潜在威胁。作为新兴非热杀菌技术，高压二氧化碳（high pressure CO2，HPCD）能有效杀死食品中微生物，保留食品品质。但申请人在前期研究中首先报道了HPCD能诱导苹果汁中微生物进入VBNC状态，并发现其也能诱导E. coli O157:H7进入VBNC状态，这使该技术在食品加工中的应用面临挑战。针对该问题，本研究以E. coli O157:H7脱毒株为目标菌，开展HPCD对该菌株VBNC状态的诱导研究，以筛选出最佳的HPCD诱导条件；基于HPCD诱导该菌株形成VBNC状态的条件筛选，利用扫描电子显微镜和透射电子显微镜对VBNC细胞的形态特征进行分析，并利用荧光光度计和API ZYM试剂盒对VBNC细胞的生理特性进行分析，为优化加工工艺和保证食品安全奠定理论基础。

活的非可培养（viable but nonculturable, VBNC）状态是非芽孢细菌在逆境条件下所采取的一种存活策略。目前已知有多种致病菌都能进入VBNC状态，这给人类健康带来潜在威胁。本项目以脱毒型食源性致病菌Escherichia coli O157:H7为研究对象，考察了高压二氧化碳（high pressure CO2, HPCD）诱导E. coli O157:H7形成VBNC状态的情况，并通过形态特性和生理特性分析初步研究了HPCD诱导其形成VBNC状态的可能机制，研究结果为进一步优化HPCD加工工艺及保证HPCD加工的食品安全奠定理论基础，具有重要的理论价值和实际意义。主要研究内容及重要结果如下：.（1）确定HPCD诱导E. coli O157:H7形成VBNC状态的诱导条件。以处理温度为参数，研究了5 MPa处理压力下HPCD对E. coli O157:H7进入VBNC状态的诱导情况，结果表明25 ℃、31 ℃、34 ℃和37 ℃四种处理温度均能诱导E. coli O157:H7进入VBNC状态，并且提高温度能够加速VBNC状态的形成。本研究首次证明了HPCD处理能够诱导E. coli O157:H7形成VBNC状态。.（2）VBNC状态E. coli O157:H7细胞的形态特征分析。利用扫描电镜和透射电镜对VBNC状态细胞进行观察，发现与对数生长期细胞相比VBNC状态细胞的外部形态和内部结构发生了明显变化。.（3）VBNC状态E. coli O157:H7细胞的生理特性分析。通过荧光光度计对膜的流动性研究表明VBNC状态细胞的膜流动性没有发生变化；采用API ZYM试剂盒对HPCD诱导产生的VBNC状态细胞进行胞内酶活测定，结果表明E. coli O157:H7进入VBNC状态后酶活降低了。.总之，HPCD处理引起E. coli O157:H7细胞发生的这些形态和生理变化使细胞进入一种活的但不可培养的状态，即VBNC状态。