高压二氧化碳诱导Escherichia coli O157:H7形成VBNC状态的分子机制

Bacteria can enter into a viable but nonculturable (VBNC) state in some adverse conditions. Although VBNC cells remain viable, they cannot be detected by traditional culture methods, and under suitable conditions they can resuscitate to culturable state, which make VBNC cells pose a potential risk to food safety. High pressure carbon dioxide (HPCD), one of the most promising non-thermal processing technologies, can kill microorganisms in food and retain food quality. However, we reported for the first time that HPCD could induce Escherichia coli O157:H7, a foodborne pathogen, to form the VBNC state, but the molecular mechanism of VBNC state of E. coli O157:H7 induced by HPCD is still not clarified. For solving this scientific problem, VBNC E. coli O157:H7 cells, having a mutation in stx gene, induced by HPCD is chosen as the research object, and the molecular mechanism of VBNC state induced by HPCD will be clarified through analyzing differentially expressed genes and proteins in VBNC cells using transcriptomics and proteomics methods, and constructing mutants to verify the function of some key differentially expressed genes and proteins, and combining with the cell wall key component analysis. This research will provide theoretical foundation for optimizing HPCD processing and ensuring food safety.

细菌在逆境条件下可进入活的非可培养（VBNC）状态，该状态的细菌用常规培养方法检测不到，但在适宜条件下能复苏，因此对食品安全构成潜在威胁。作为新兴非热杀菌技术，高压二氧化碳（HPCD）能有效杀死食品中微生物，保留食品品质。申请人在前期研究中发现HPCD能诱导Escherichia coli O157:H7进入VBNC状态，但其分子形成机制仍不清楚。针对该问题，以缺失stx志贺毒素基因的E. coli O157:H7为目标菌，采用转录组和蛋白组学方法分析VBNC状态细胞中的差异表达基因和蛋白，并构建突变体对关键差异表达基因和蛋白进行功能验证，同时结合对细胞壁关键组分的分析，揭示HPCD诱导E. coli O157:H7形成VBNC状态的分子机制。该研究可为优化HPCD加工工艺及保证食品安全奠定理论基础。

在外界逆境的胁迫下，细菌可进入活的非可培养（VBNC）状态，该状态下的细菌用常规平板培养的方法检测不到，然而在适宜条件下能复苏，对食品安全造成了潜在的威胁。高压二氧化碳（HPCD）作为新兴非热杀菌技术，可有效杀灭食品中微生物并保留食品品质，但HPCD能诱导Escherichia coli O157:H7进入VBNC状态，其分子形成机制仍不明确。针对该问题，本研究以缺失stx志贺毒素基因的E. coli O157:H7作为目标菌株，首先采用转录组和蛋白组学分析VBNC状态细胞中的差异基因和蛋白。研究发现，97个基因及56个蛋白在VBNC细胞中差异表达了，这些基因/蛋白主要参与了碳水化合物、氨基酸、核苷酸的转运及代谢，DNA复制及重组，转录与翻译，致病性等方面。然后，通过对关键差异表达基因和蛋白的功能验证，研究发现外膜蛋白OmpF和转录因子z2046（dicC）对VBNC状态的形成具有显著影响。其次，本研究首次采用SYTO & PI双染HPCD处理后的细胞，经流式细胞仪分选得到了纯的VBNC细胞，并通过非靶向代谢组学研究分析了细胞壁及细胞膜差异组分。最后，通过以上研究分析，提出了HPCD诱导E. coli O157:H7进入VBNC状态的机制：HPCD处理降低或抑制了E. coli O157:H7细胞的物质转运与代谢活性（如碳水化合物转运与代谢、氨基酸转运与代谢、核苷酸代谢等）、DNA复制与重组活性、转录与翻译活性，在该情况下细胞生长速率却增加了，导致细胞无法生长成正常大小，细胞呈短圆状，这有利于细胞在不利条件下存活并形成VBNC状态。在该状态下，细胞的肽聚糖成分未发生显著变化，而细胞膜的不饱和脂肪酸组分却有所减少，可能是长链的脂肪酸降解成了更短链的脂肪酸，过程中引入更多的双键来增加不饱和度，从而更好地维持细胞膜的流动性，在不利条件下维持其正常的生物功能。