蓝舌病1型病毒VP2蛋白型特异性表位定位研究

Bluetongue Disease is a serious arbovirus disease in sheep and cattle caused by Bluetongue Virus. Total 24 serotypes of BTV have been identified and there is no cross immunologic protection among serotypes of BTV. The serotype-specificity is mainly determined by the protein VP2. Serotype 1 of BTV, firstly isolated in Yunnan in 1979 and caused a big loss in sheep in history, is the major one for endemic in China. Based on the previous study, Immunoreactivities of different phage mimotopes to the serotype-specific antibody against serotype 1 of BTV will be analyzed by employing ELISA, competitive ELISA, Western blot and virus neutralization with both 12 and 7-mer random peptide phage display library, and further sequence of amino acid residues specific epitope achieved. The epitope will be further confirmed by expression in segmentation, gene deletion, orientation mutation and synthesized peptides, and finally fine epitope mapping composing of 1-2 key amino acid residues achieved. This study will benefit for research and development of gene engineering vaccine and provides with theoretical and practical foundation for prevention and control of the disease.

蓝舌病是由蓝舌病病毒引起的严重危害、羊等反刍动物的虫媒病毒病，目前已知蓝舌病病毒有24个血清型，血清型间抗体不能交叉保护，VP2蛋白决定其型特异性。1979年在云南首次分离的蓝舌病1型病毒是我国流行的主要血清型，历史上曾引发我国绵羊发病、死亡。本研究在获得蓝舌病1型病毒型特异性抗体的基础上，应用蓝舌病1型病毒型特异性抗体淘选噬菌体展示的12肽和7肽随机肽库，采用ELISA、竞争ELISA、免疫印迹和病毒中和试验分析不同噬菌体拟位与蓝舌病1型病毒型特异性抗体的免疫反应性，获得VP2蛋白型特异性表位氨基酸序列。根据噬菌体淘选结果对蓝舌病1型病毒VP2蛋白进行分段表达、基因缺失、定向突变和合成肽对蓝舌病1型病毒型特异性表位进行验证，最终获得蓝舌病1型病毒VP2蛋白1-2个表位关键性氨基酸精细定位，认识表位抗原性差异的分子基础。本研究将有助于该病基因工程疫苗的开发，为该病的防控奠定理论和实践基础。

蓝舌病是由蓝舌病病毒引起的严重危害、羊等反刍动物的虫媒病毒病，目前已知蓝舌病病毒有27 个血清型，血清型间抗体不能交叉保护，VP2 蛋白决定其型特异性。1979 年在云南首次分离的蓝舌病1 型病毒是我国流行的主要血清型，历史上曾引发我国绵羊发病、死亡。本研究应用蓝舌病1 型病毒型特异性抗体淘选噬菌体展示的12 肽和7 肽随机肽库，对筛选获得共有序列噬菌体，采用ELISA、竞争性ELISA分析，发现含有TTPNNLS基序的噬菌体拟位和含有PHPNPANRLYTS基序的噬菌体拟位能够与BTV1型特异性抗体发生特异性结合，并且该结合能够被BTV1阻断，表明拟位多肽真实模拟病毒蛋白上的抗原表位；经比较分析，在BTV1 VP2蛋白的第865-873位氨基酸序列与获得共有序列TPN相似；表明BTV1 VP2蛋白的865-THPNKCLVA-873位氨基酸构成BTV1VP2蛋白特异性表位。通过抗蓝舌病1型病毒VP7蛋白单克隆抗体淘选噬菌体展示的7肽随机肽库，对筛选的共有序列噬菌体进行ELISA、竞争性ELISA分析，发现BTV1型病毒VP7蛋白的第163-LNAGARGDVQQIFQGRNDPMMIYLVWR-189位氨基酸构成蓝舌病病毒VP7蛋白特异性表位。BTV VP2蛋白在pEASY-Blunt E1 载体上以包涵体形式表达，纯化获得BTV VP2重组蛋白，分子量约105 ku，免疫印迹、ELISA、阻断ELISA结果证明重组BTV-1 VP2蛋白能与蓝舌病1型病毒型特异性抗发生特异性结合，且此结合能被BTV-1阻断。通过基因分段表达和合成肽相结合的方法进一步证明865-THPNKCLVA-873位氨基酸构成BTV1VP2蛋白特异性表位。应用获得的BTV1型特异性噬菌体展示拟位建立了BTV1型病毒竞争ELISA 检测方法。 本研究将有助于该病基因工程疫苗的开发，为该病的防控奠定理论和实践基础。