蓝舌病病毒NS1蛋白微管的形成机制与功能

Bluetongue virus (BTV), an arboviral pathogen, is a member of the genus Orbivirus within the family Reoviridae that causes a severe disease in ruminants including sheep, goats, cattle and deer and is endemic in most parts of the world. NS1 protein is the most abundant viral nonstructural protein synthesized in infected cells, which is able to form the tubules as the polymerization product within the cytoplasm. However, the formation mechanism and definitive role of virus-specific tubules during BTV infection remains unclear. In this project, BTV reverse genetic system, established in our laboratory, will be used to rescue a series of recombinant BTVs by introducing mutation into NS1 protein. The intracellular location and trafficking of NS1 protein in live and fixed cells will be characterized by biarsenical-tetracysteine technology and confocal microscopy. This project will also investigate the formation of NS1 tubules by site-directed mutation approach and their effect on virus rescue and virulence by electron microscopy and pathogenicity test in sheep, respectively. This study will comprehensively elucidate the tubule formation and function of NS1 protein during virus infection, which will be helpful for understanding BTV pathogenesis, virulence determinant, virus-cell interaction, and also pave the way for the research on antiviral drugs and novel vaccines for BTV.

蓝舌病病毒（BTV）是呼肠孤病毒科环状病毒属的一种虫媒病毒，能够感染羊、牛、鹿等反刍动物，已流行于全球大部分地区。NS1是BTV感染细胞后表达量最高的病毒蛋白，且其在细胞质中可以多聚体形式形成微管结构。然而，NS1微管的形成机制及其在BTV感染过程中的作用至今仍不清楚。本项目拟以本实验室建立的BTV反向遗传操作系统为平台，通过对NS1基因进行突变拯救构建一系列重组突变病毒，利用双砷染料/四半胱氨酸蛋白示踪、共聚焦显微镜、电镜和动物感染实验等技术，研究NS1野生型及突变型蛋白在感染细胞内的相对定位及示踪，同时通过对NS1上氨基酸基序的突变研究微管的形成与病毒拯救及致病性的相互关系。本研究将全面阐明NS1微管在BTV感染和致病过程中的作用机制，这将有助于揭示BTV的致病机理、病毒毒力因子以及病毒与细胞的相互作用，同时也将为研制BTV的抗病毒药物和新型基因工程疫苗奠定坚实基础。

蓝舌病是由蓝舌病病毒（Bluetongue virus，BTV）引起的一种严重侵害羊、牛、鹿等反刍动物的烈性传染病。BTV是呼肠孤病毒科环状病毒属的一种典型虫媒病毒，其基因组编码7种结构蛋白（VP1-VP7）和4种非结构蛋白（NS1-NS4）。NS1蛋白是BTV感染细胞后表达量最高的病毒蛋白，约占病毒编码总蛋白的25%，且其在细胞质中多聚化后形成明显的微管结构，然而NS1蛋白在BTV感染致病过程中的作用仍不清楚。本项目首先利用BTV反向遗传操作系统成功拯救了NS1上分别在156位和493位氨基酸后融合表达四半胱氨酸（Tetracysteine，TC）标签的重组病毒，利用双砷染料（FlAsH或ReAsH）/TC技术、共聚焦显微镜技术研究了重组BTV感染细胞中NS1蛋白的表达分布，两株表达TC标签的重组病毒均能被双砷染料染色，重组病毒用双砷染料染色后和NS1抗体荧光染色后其NS1蛋白分布特征相似，均分布于细胞质中，NS1蛋白与BTV dsRNA、NS2蛋白未发现共定位，而NS1与NS3蛋白显示共定位；利用体外表达系统成功表达了BTV NS1以及VP5、VP6、VP7、NS2、NS3等多种病毒蛋白并对其纯化，免疫新西兰大白兔制备获得了针对BTV蛋白的多克隆抗体，这些抗体均能与相应的BTV天然蛋白反应，为相关研究提供了关键的抗体工具；选择NS1蛋白上可能与微管结构形成有关的半胱氨酸突变为丝氨酸，利用BTV反向遗传系统和建立的稳定表达NS1蛋白的细胞系未拯救到NS1上半胱氨酸突变的病毒，发现NS1上30、37、43、337、340、462、465、513、518、533位的半胱氨酸突变均为致死性突变，影响病毒拯救，表明这些残基在NS1蛋白功能和病毒复制过程中具有重要作用；建立了羊肾细胞的酵母cDNA表达文库，利用酵母双杂交技术筛选到了18个与NS1互作的细胞蛋白。本项目为进一步阐明NS1蛋白在BTV感染过程中的作用机制提供了基础，也为下一步开展相关研究搭建了研究平台。