我国剧毒鹅膏真菌环肽毒素生物合成关键酶POP基因研究

Lethal Amanita species, containing the potent toxic cyclopeptides, are responsible for the most mushroom poisonings, but which were also the important new drug resources for their broad application prospects in the life sciences. Prolyl oligopeptidase (POP) is known as the key enzyme in the biosynthesis of the Amanita toxins, however, few studies have been reported in this key enzyme, especially in the lethal Amanita species endemic in China. In this study, the primers will be designed basing on the POP unigene sequences to clone the full-length cDNA sequences of POP in those lethal Amanita species, then to analyze the characterizations of the cDNA and protein sequences, to construct the phylogenetic tree of the POP genes among the fungi, bacterials, animals and plants, and to investigate the phylogenetic relationships between the Amanita species and other species; the POP gene copy and expression patterns in the toxic and nontoxic Amanita species will be studied by DNA blotting; quantitative real-time PCR will be conducted to detect the transcription levels of the POP genes in the different parts and development stages of the lethal Amanita species, and to explore the correlation between the POP gene transcription levels and the Amanita toxins accumulation. This study will lay an important molecular foundation for breakthroughing the biosynthesis of Amanita toxin genes.

剧毒鹅膏菌是毒蘑菇中毒事故的头号杀手，其所含环肽毒素既具强致死性，又有广阔应用前景，是医药业寻找新药物的重要资源。脯氨酰寡肽酶（POP）是鹅膏肽类毒素生物合成过程中一种关键酶，但目前对该酶基因的研究很少，尤其是对我国剧毒鹅膏菌相关酶基因还未见报道。本项目利用前期研究中致命鹅膏菌转录组测序获得的POP unigene基因序列设计引物，扩增和克隆我国剧毒鹅膏菌POP基因的全长cDNA和基因组DNA，解析该基因及其预测蛋白的序列特征，构建毒鹅膏菌与其他菌类、动植物等不同生物类群的POP系统进化树，探讨其进化关系；同时经DNA杂交研究POP基因的拷贝现象，以及在有毒和无毒鹅膏菌中的表达情况；并对该酶基因在同一剧毒鹅膏不同组织和生长时期的表达量进行分析，探索POP基因在子实体发育过程中的表达与毒素含量累积的关系。本研究将为突破鹅膏环肽毒素生物合成的科学难题奠定重要的分子生物学基础。

脯氨酰寡肽酶（POP）是鹅膏肽类毒素生物合成过程中的关键酶，但在我国剧毒鹅膏菌中，该酶相关基因研究相对较少。本项目克隆获得了两种剧毒鹅膏菌致命鹅膏及裂皮鹅膏中的POPA和POPB基因，明确了各基因的结构组成，并对其预测编码的蛋白结构进行了分析，结果显示致命鹅膏和裂皮鹅膏中的POPA和POPB蛋白与已报道的双孢鹅膏及纹缘盔孢伞中的POPA和POPB同源性均达到了70%以上；同时构建了POPA和POPB的系统进化树，分析结果显示，POPA是普遍存在的脯氨酰寡肽酶（POP）家族成员，而POPB是特异存在于剧毒鹅膏中的成员；此外，本项目研究了POPB在致命鹅膏（AePOPB）不同生长时期和不同组织部位中的表达规律，结果显示，在致命鹅膏子实体不同部位中，子实体发育延伸初期和后期，AePOPB在菌柄中的表达量最高，其次为菌盖和菌托；子实体发育成熟期及成熟后期，AePOPB在菌盖中的表达量最高，其次为菌柄和菌托；而在不同发育阶段，延伸后期菌盖中AePOPB表达量最高，其次为延伸初期、成熟期及成熟后期；延伸初期菌柄和菌托中AePOPB表达量最高，其次为延伸后期、成熟期及成熟后期；对比致命鹅膏毒素α-amanitin合成基因Ae α-AMA的表达规律以及毒素含量的积累，结果显示AePOPB在不同发育阶段及不同部位的表达与α-amanitin合成关键基因Ae α-AMA的表达规律一致，且在表达高峰期后一阶段均伴随有毒素含量积累的高峰期。上述结果表明，AePOPB与α-amanitin合成密切相关。本项目对AePOPB基因拷贝数进行了southern 杂交检测，初步分析AePOPB基因在致命鹅膏基因组中可能以双拷贝的形式存在。本项目研究结果为后期深入探究剧毒鹅膏环肽毒素生物合成及其相关基因功能奠定重要的分子生物学基础。