致命鹅膏菌的毒素编码基因克隆及其多态性研究

剧毒鹅膏菌是毒蘑菇中毒死亡的头号杀手，其含有的鹅膏毒素具有强致死性，但同时又具广阔的应用前景，是医药业和农药业寻找新药物的重要资源。鹅膏毒素的相关研究一直备受关注，但主要集中在生理生化方面，对鹅膏毒素基因的相关研究很少，我国至今仍未见报道。.本项目利用我国特有的致命鹅膏菌为材料，克隆和测定其主要毒素的编码基因，并对编码基因进行序列分析，获取其功能信息。研究致命鹅膏和其他不同毒鹅膏菌毒素编码基因的多态性，分析毒素种类多样性与其编码基因多态性的相关性。同时通过对致命鹅膏菌不同生长时期，其主要毒素编码基因进行检测，探讨毒素编码基因在该菌不同生长时期的表达差异。.本研究将首次解析我国特有剧毒鹅膏菌主要毒素编码基因的序列信息、遗传多样性及其发生规律，研究结果将对建立有毒鹅膏菌的分子生物学快速检测技术，突破鹅膏毒素批量生产，开拓毒素基因药物等方面的应用研究奠定重要基础，具有重要的科学意义和社会意义。

剧毒鹅膏菌是毒蘑菇中毒死亡的头号杀手，其含有的鹅膏毒素既具强致死性，又有广阔的应用前景。项目首次克隆并分析了致命鹅膏Amanita exitialis的α-amanitin和phallacidin的编码基因全长序列；其分别编码35和34个氨基酸前体肽，该前体肽具较保守的上下游区域，中间为7-8个氨基酸组成的可变性高的毒素编码区；通过毒素基因简并引物从致命鹅膏菌基因组DNA中扩增获得了编码9条毒素及相关肽类序列，包括α-amanitin、β-amanitin、phallacidin、amaniexitide等毒素序列，以及三条未知功能的新肽类序列。.为分析剧毒鹅膏毒素基因多态性，项目从致命鹅膏、灰花纹鹅膏、拟灰花纹鹅膏、淡玫红鹅膏、皱盖鹅膏和绿盖鹅膏等6种剧毒鹅膏种类中共获得了54条毒素及相关肽类的基因序列，占目前数据库中已报道的毒素基因家族成员的70.1%。其中有20条序列是编码α-amanitin，5条序列编码β-amanitin，16条序列编码phallacidin，其他13条为未知功能的新肽类序列。研究表明剧毒鹅膏菌含有丰富的肽类毒素相关编码基因，不同的种存在部分相同基因，也存在一些特异性基因。.本项目首次采用qRT-PCR技术分析致命鹅膏子实体四个不同生长时期和三个不同部位毒素α-amanitin编码基因（α-AMA）的表达水平。研究结果表明：α-AMA在致命鹅膏菌的各个生长阶段和不同部位中均可表达，但表达水平不均衡：在四个生长时期中，α-AMA在延伸期初期的整个子实体内具有较高的表达水平；除了延伸期初期外，在其他三个生长时期中均是α-AMA在菌伞中具有最高的表达水平。这说明α-AMA的表达水平是与致命鹅膏菌子实体的生长旺盛程度相关的，与毒素含量变化表现出一致性。.为更深入系统地了解致命鹅膏毒素基因，项目增加了该菌子实体的转录组测序分析，研究共得到25,563,688个高质量序列，注释了27,848个单基因簇，鉴定了27,826个编码基因序列，共发现1,254个SSR和11个毒素基因家族成员的单基因簇。.本项目发表第一标注论文11篇（其中SCI论文5篇），授权专利1项，培养博士研究生1名。研究结果对建立有毒鹅膏菌的分子生物学快速检测技术，突破鹅膏毒素批量生产，开拓毒素基因药物等方面的应用研究奠定重要基础，具有重要的科学意义和社会意义。