Aurora B和TTK激酶协同作用调控染色体分离保真性的分子机制研究

纺锤体检验点是一个保证精确的染色体分离的生存机制，其功能的部分丧失产生非整倍体的子代细胞，将会促进细胞向肿瘤细胞转化。TTK/Mps1激酶是纺锤体检验点关键组分，其参与纺锤体检验点的功能都是保守的和必需的，但是我们对TTK在检验点中的生化通路和分子机制还知之甚少。我们的预实验结果表明Aurora B激酶调控TTK的动点定位和活性，结合已有文献，这些结果提示Aurora B/CPC复合物和TTK激酶之间存在正反馈环调控。我们将利用分子生物学、细胞生物学、生物光子学等学科的技术手段，剖析CPC复合物和TTK激酶协同调控染色体分离保真性的详尽功能和机制。我们还将利用TTK激酶活性的荧光探针描绘TTK活性的细胞周期时空动态性。最后，我们将利用串联亲和层析和蛋白质组学的方法鉴定分析TTK的结合蛋白和底物。我们希望通过本研究计划阐明TTK蛋白激酶的信号转导机制及涉及的蛋白质群。

纺锤体检验点是一个保证精确的染色体分离的生存机制，其功能的部分丧失产生非整倍体的子代细胞，将会促进细胞向肿瘤细胞转化。Mps1/TTK激酶是纺锤体检验点关键组分，其参与纺锤体检验点的功能都是保守的和必需的，但是我们对Mps1在检验点中的生化通路和分子机制还知之甚少。我们的预实验结果表明Aurora B激酶调控Mps1的动点定位和活性，结合已有文献，这些结果提示Aurora B/CPC复合物和Mps1激酶之间存在正反馈环调控。通过本项目的实施，我们发现Mps1的动粒定位的受体为Hec1。Mps1与Hec1的微管结合结构域直接相互作用。敲低内源Hec1后，野生型Hec1可以恢复Mps1的动粒定位，但是缺失了微管结合结构域的Hec1则不能。我们进一步发现Aurora B对Hec1的磷酸化极大地促进了Mps1的动粒定位。与不可磷酸化的Hec1突变体相比，表达模拟磷酸化的Hec1突变体显著上调了Mps1的动粒定位，并且在此条件下不依赖于Aurora B激酶活性。表达模拟磷酸化的Hec1突变体同样上调了Mad2的动粒定位，同样Mad2在此条件下的动粒定位越过了对Aurora B激酶活性的依赖。与文献相一致，利用选择性定位于正确连接的动粒的蛋白SKAP，我们的数据表明表达模拟磷酸化的Hec1突变体导致了动粒-微管连接的去稳定。进一步的表型分析表明表达不可磷酸化的Hec1突变体导致检验点功能的部分损害，而表达模拟磷酸化的Hec1突变体导致长时间的有丝分裂阻断并最终破坏了有丝分裂的精确完成。我们的研究揭示了Mps1动点定位的分子机制，提示Aurora B对Hec1的磷酸化直接偶联了动粒微管连接与检验点信号转导。与国际同行的合作，我们参与解析了Mps1分子N端TPR结构域1.8 Å的晶体结构。总体上，Mps1 TPR结构域的结构与Bub1/BubR1的TPR结构是类似的。但是，与Bub1/BubR1的TPR不同的是，Mps1的TPR结构域不具有结合KNL-1的结构特征。此外，我们发现Mps1分子N端的肽段(aa.1-55)介导Mps1的二聚化，破坏二聚化干扰了Mps1的动粒定位和正确的活性。综上所述，我们回答了本研究计划的关键科学问题，揭示Aurora B与Mps1以Aurora B-Hec1-Mps1信号轴来协同调控纺锤体检验点功能，保证染色体分离保真性。