着丝粒蛋白质复合物CENP-L-N的组装动态性与功能研究

The failure of faithful chromosome segregation during mitosis will generate aneuploidy daughter cells and chromosomal instability (CIN). CIN will drive aggressive tumorigenesis by allowing tumor to evolve rapidly and acquire malignant transformation ability. The accurate assembly of centromere chromatin and kinetochore is the prerequisite of faithful mitotic progression. Inner kinetochore, also called constitutive centromere associated network (CCAN), provide structural basis for the assembly of outer kinetochore. Moreover, CCAN also plays a function in the CENP-A centromere deposition (centromere identity maintenance). Therefore, elaborating the function and assembly of CCAN is of great value to promote the health of human being. CENP-L-N is a key subcomplex of CCAN. However, the detailed function and molecular mechanism of CENP-L-N remain poorly understood. In this proposal, we aim to explore the function of CENP-L-N in chromosome alignment and chromosome oscillation using the combination of knock-out cell line, knock-in cell line and RNAi. We will explore the biochemical basis of cross-talk between CENP-L-N and CENP-H-I-K-M by multiple biochemical study methods and will also address physiological function of interaction of CENP-L-N with CENP-H-I-K-M. Through the establishment of SNAP-tag cell line, we will dissect the dynamic centromere deposition of CENP-N in cell cycle using biophotonics methods. Last, we also aim to identify the post-translational modification (PTM) of CENP-N and explore the function of key PTMs. Overall; we aim to address the function of CENP-L-N in accurate mitosis and its role in CCAN assembly plasticity. We hope our research will provide novel knowledge for the elucidation of function and assembly of centromere/kinetochore.

有丝分裂的错误会产生非整倍体子细胞，危害个体发育与健康。着丝粒染色质与动粒的正确组装则是有丝分裂精准完成的前提。内层动粒即CCAN网络为外层动粒的组装提供结构基础，同时也调控了着丝粒的稳定遗传。因此，阐明CCAN的功能与组装具有重要科学意义。CENP-L-N是CCAN的一个亚复合物，其功能和动粒定位机制仍尚未被阐明。我们拟利用knock-in/out细胞系/RNA干扰与成像技术相结合的手段研究CENP-L-N复合物的有丝分裂功能，阐明CENP-L-N如何促进染色体排列和染色体震荡。我们将利用多种生化手段阐明CENP-L-N和其他CCAN组分特别是CENP-H-I-K-M复合物相结合的分子基础和生理意义。我们还将解析在细胞周期中CENP-N在动粒动态定位的动力学特征，探究CENP-N的翻译后修饰及其功能。通过本项目的实施，我们预期研究结果将增进对动粒的功能与动态组装的认识。

高等真核生物的个体发育和物种延续，离不开细胞有丝分裂。为了完成精准的细胞有丝分裂，染色体着丝粒部位的动粒必须在细胞周期过程中正确地组装。CENP-N蛋白是动粒内层CCAN复合物中的关键组分，直接结合CENP-A核小体，并且和CENP-L形成亚复合物。为此，解析CENP-LN复合物的动态组装和功能具有重要的科学意义。在本项目中，我们对CENP-N的功能和磷酸化调控、CENP-L/N的DNA结合活性进行了详细解析。我们的研究发现CDK1激酶在分裂期磷酸化CENP-N并鉴定了S299位是关键的磷酸化位点。通过免疫共沉淀实验，我们发现S299的模拟磷酸化破坏了CENP-L/N的相互结合。进一步对S299A、S299D突变体的定位和表型进行了研究，发现模拟磷酸化导致CENP-N在着丝粒定位强度减弱和有丝分裂染色体排列错误的发生。有趣的是，不可磷酸化的S299A突变体也导致相对温和的有丝分裂错误。这部分结果揭示了CENP-N磷酸化调控了CENP-LN复合物的动态组装，保证了精准的有丝分裂。我们与结构生物学课题组合作解析了人源CCAN复合物的冷冻电镜结构。国际上两个课题组也几乎同时发表了人源CCAN的结构解析。在CCAN复合物中，CENP-N不再直接结合CENP-A核小体，而是整个CCAN复合物形成一个“隧道”，缠绕了CENP-A核小体延伸的连接DNA。在CCAN复合物中，CENP-LN位于中心位置，和DNA具有广泛的结合。我们对CENP-N、CENP-L的潜在的DNA结合残基的突变体进行了研究，发现CENP-N和CENP-L的DNA结合活性对于两者在分裂期的着丝粒定位都是至关重要的。同时，活细胞成像实验表明CENP-N和CENP-L的DNA结合活性对于精准的有丝分裂进程也是必需的。这部分结果为动粒的组装和功能的分子机制提供了新的见解。