VlpA分子长度变化对猪鼻支原体黏附细胞的影响及机制解析

The variable lipoprotein (Vlp) family is critical for Mycoplasma hyorhinis to generate high-frequency surface antigenic variation and evade the host immune system; in addition, Vlp is the only identified adhesion molecule. Size variation is an important form of variation of Vlp, but the exact biological significance of which is not clear yet. In our previous study, the cytoadhesive abilities of all the Vlp members have been found to be reduced as the size of the molecules increased. It indicated that the size variation of Vlp plays an important role in the cytoadhesion of Mycoplasma hyorhinis. Herein, further studies would be carried out by using the widely expressed Vlp member A (VlpA) as a template. Strains expressing different size of VlpA would be acquired through genetic manipulation or antibody pressure-induced mutation. The cytoadhesion mediated by VlpA alone, as well as the cytoadhesion mediated by VlpA together with other adhesion molecules would be detected and compared between these strains. The surface exposure of the adhesion sites and the distribution relationship of the related proteins or regions would be detected to explore the underlying reason for the changes in cytoadhesion. Furthermore, the crystal structures of the VlpA proteins of different size would be analyzed to further study the mechanism at the atomic level.The present study would reveal the influence and mechanism of Vlp size variation on the cytoadhesion of Mycoplasma hyorhinis. It could also provide valuable reference for the studies on the influence of variable proteins in the infection and immune escape of mycoplasmas.

可变蛋白家族Vlp是猪鼻支原体表面抗原特征高频变异、逃避宿主免疫系统的重要工具，同时也是唯一鉴定的黏附因子。分子长度变化是Vlp高频变异的重要形式之一，但其确切的生物学意义不明。前期研究发现全部Vlp家族成员的黏附功能均随分子长度增加而减弱，提示Vlp长度变化在支原体黏附中具有重要作用。本项目以家族中广泛表达的成员A（VlpA）的长度变化为切入点，利用遗传操作系统突变和抗体压力诱变获得VlpA长度表型差异菌株，比较其由VlpA自身介导的黏附差异，以及其他黏附蛋白共同介导的支原体整体黏附能力差异。通过黏附位点表面暴露性、不同蛋白或区段的空间分布关系检测，分析黏附变化机制。在此基础上通过解析和比较不同长度VlpA的晶体结构，进一步从原子层面阐释上述机制。本研究不仅可揭示Vlp长度变化影响黏附的机制，也为阐明可变蛋白在支原体感染、免疫逃逸中的生物学意义提供理论依据和重要数据参考。

猪鼻支原体（Mhr）的临床感染率极高，可引起猪多发性浆膜炎、关节炎等多组织慢性炎症，同时也与多种人类肿瘤发生发展相关。黏附是支原体感染致病的前提和关键步骤。可变蛋白(Vlp)家族是Mhr表面抗原特征高频变异、逃避宿主免疫系统的重要工具，其变异主要通过不同成员表达组合的切换及其分子长度变化两种形式实现。前期研究已证明Vlp为Mhr的黏附因子之一。本研究以VlpA为代表深入研究Vlp分子长度变化对Mhr黏附细胞的影响。首先研究VlpA分子长度变化对其自身介导黏附能力的影响：研究结果发现短VlpA分子(VlpA1)黏附细胞能力强于长VlpA分子（VlpA16）；通过功能域和位点细化扫描解析明确了VlpA的黏附位点主要位于分子N端Ⅱ区的P3C段（51-65位）；VlpA抗体可显著抑制短VlpA表型的Mhr黏附细胞，而不影响长VlpA表型的Mhr黏附细胞；结合不同VlpA长度表型菌株中VlpA不同区段表面暴露性的对比分析，证明了VlpA分子长度变化可通过影响VlpA关键黏附位点的表面可及性而干扰其本身介导Mhr黏附功能的发挥。在此基础上进一步研究VlpA分子长度变化对Mhr表面其他黏附因子黏附功能的影响及对Mhr整体黏附能力的影响：研究结果发现长VlpA表型菌株的整体黏附能力弱于短VlpA表型菌株；鉴定了4种Mhr黏附因子，分别为GAPDH、EF-Tu、enolase和DnaK，比较了不同VlpA长度表型菌株中5种已知黏附因子介导Mhr黏附能力的变化，发现部分黏附因子的表面暴露性受到VlpA长度变化的影响，从而影响其介导细胞黏附功能的发挥。分析对比不同长度VlpA分子结构，提示VlpA长度增加时Ⅲ区β片层结构域增大，可能造成空间位阻影响该位置VlpAⅡ区黏附位点及附近其他黏附因子的暴露性，从而干扰后者黏附功能的发挥，进而影响Mhr整体黏附能力。本研究阐明了VlpA长度变化对Mhr黏附的影响及分子机制，为Mhr感染致病研究提供了重要数据参考，也为Mhr诊断标准化和亚单位疫苗研究提供依据。由于可变蛋白的分子长度变化在支原体中普遍存在，本结果也为其他支原体的可变蛋白生物学功能研究提供重要启示。