胃癌来源exosomes对腹膜间皮细胞损伤、腹膜黏附性影响及机制研究

腹膜间皮损伤及黏附性改变在胃癌腹膜转移发生中起关键作用，近年研究发现卵巢癌腹水exosomes表达的MMPs及uPA可降解腹膜细胞外基质，促进卵巢癌腹膜转移。我们前期研究发现胃癌腹水exosomes表达FasL及TraiL等凋亡配体，结合腹膜间皮细胞对FasL诱导的凋亡敏感及exosomes在细胞间通讯及蛋白质、mRNA传递中的重要作用，提出胃癌腹水exosomes可能在腹膜间皮细胞损伤及腹膜黏附性改变中发挥重要作用。本研究拟首先系统检测胃癌腹水exosomes的免疫及基因表型，推测其作用靶分子；采用共聚焦显微镜等方法观测exosomes是否引起间皮细胞形态改变及凋亡；通过体外建立三维腹膜模型，检测exosomes处理后癌细胞黏附及侵袭腹膜能力的改变；动物实验观察其是否促进胃癌腹膜转移瘤发展；最后通过抗体阻断，初探其诱导腹膜损伤及黏附性改变的分子机制。从而加深对胃癌腹膜种植转移机制的理解。

腹膜转移是恶性肿瘤进展过程中常见的转移形式，一般提示疾病晚期及极差的预后。我们假设胃癌腹水exosomes可能在腹膜间皮细胞损伤及腹膜黏附性改变中发挥重要作用。试验进程中，我们首先使用Exo-Quick exosome isolation试剂盒法提取exosome，采用透射电子显微镜TEM鉴定exosome的形态及大小，Western blot检测exosome膜上表达的分子markers—CD63、CD9、CD81，证实提取物为25-50nm直径大小的膜泡盘状结构，内部浅染色，呈聚集分布，大小较为一致的exosome；然后利用PKH-26对exosome沉淀进行染色，让exosome与人腹膜间皮细胞HMrSV5共孵育，使用DAPI对细胞核进行染色，普通荧光显微镜观察染色的exosome进入到人腹膜间皮细胞内部；然后采用不同浓度的的exosomes处理人腹膜间皮细胞HMrSV5，CCK8试验及划痕试验均观察到间皮细胞的增殖；接着我们将exosome与人腹膜间皮细胞HMrSV5共孵育72小时观察间皮细胞的细胞表型变化：细胞形态学上，高倍显微镜下间皮细胞呈现CAFs类似样细胞的纺锤形态；蛋白组学上，Western blot定性结果显示CAFs表型的蛋白分子FAP、vimentin均表达增加，且灰度值半定量分析FAP蛋白表达增加具有统计学意义（P=0.046）；基因学上，RT-qPCR分析显示调控CAFs表型的蛋白分子FAP和Vimentin的mRNAs表达上调，而调控α-SMA的mRNAs表达下调；最后收集新鲜正常腹膜组织及肿瘤转移腹膜组织进行组织免疫化学对比，发现肿瘤腹膜转移癌间皮细胞组织免疫组织化示CAFs表型的蛋白分子FAP、vimentin、α-SMA的高表达。因此，我们结果发现胃癌来源的exosome能够促进人腹膜间皮细胞HMrSV5的增殖及向肿瘤相关成纤维细胞CAFs转化进而促进腹膜转移癌的形成，而非如我们在原项目计划书中陈述的影响间皮细胞的粘附性。