米曲霉酰基辅酶A结合蛋白水平与成味脂肪酸代谢关系的研究

酱油酿造是由制曲过程中微生物产生的酶对原料中的蛋白质和淀粉进行分解，形成酱油特有的色、香、味、体的过程，其风味的形成与脂肪酸代谢密切相关，而脂肪酰基辅酶A结合蛋白是脂肪酸代谢中的关键蛋白，该蛋白是研究米曲霉脂肪酸代谢途径是否参与风味物质形成的切入点。本项目旨在从米曲霉中克隆酰基辅酶A结合蛋白基因，通过原核表达，制备抗体，通过该蛋白定量分析及免疫荧光区域定位，在亚细胞水平研究其在酱油不同发酵时期的分布及水平，探索米曲霉脂肪酸在菌丝体各部位的运输和分布途径，结合测定不同发酵时期的风味物质的种类及水平，揭示米曲霉脂肪酸代谢与风味物质的相关性；综合对酰基辅酶A结合蛋白过表达的米曲霉工程菌株与风味物质积累的量效关系，分析米曲霉成味脂肪酸代谢途径，为定向开发品质优良风味独特的米曲霉菌株奠定理论基础。

酱油酿造的主要微生物是米曲霉，它产生的各种酶对原料中的蛋白质和淀粉进行分解而形成酱油的主要成分。目前较少有涉及酱油中脂肪酸如何形成分子代谢途径的研究。本课题从米曲霉脂肪酰基辅酶A结合蛋白作为着眼点，初步探究了该蛋白在米曲霉脂肪酸分子代谢中的作用及路径。本课题使用了反转录PCR技术从米曲霉mRNA中克隆了米曲霉酰基辅酶A结合蛋白(AoACBP)基因，通过尝试不同的原核表达载体，在pMAL系统中成功表达了高纯度的MBP-AoACBP融合蛋白，利用微量热泳动仪（MST）测试了酰基辅酶A结合蛋白与不同碳链长度的酰基辅酶A之间的亲和力，通过实时定量PCR实验测试了不同生长时期米曲霉的AoACBP基因转录水平变化，利用表达的蛋白制备了特异性的多克隆抗体，进而对米曲霉不同生长时期做了western实验，对标记抗体做了不同生长时期米曲霉菌丝体的免疫荧光区域定位实验，构建了米曲霉酰基辅酶A结合蛋白过表达载体，利用米曲霉代谢组学测定脂肪酸与不同生长时期米曲霉的酰基辅酶A结合蛋白相关性。微量热泳动实验表明米曲霉酰基辅酶A结合蛋白与C20酰基辅酶A的结合能力最强，Kd值为23nM，定量PCR和Western bloting等定量实验显示着米曲霉生长周期的后期，其酰基辅酶A结合蛋白水平呈增加的趋势，免疫荧光区域定位实验表明了酰基辅酶A结合蛋白主要定位于其生长周期后期的孢子囊和孢子上，米曲霉代谢组学表明了C16烷酸、C18烷酸水平与酰基辅酶A结合蛋白水平在米曲霉菌丝体的增长趋势呈现一致关系。本课表明了米曲霉酰基辅酶A结合蛋白在米曲霉不同生长时期的重要作用，尤其对于孢子的形成，因此为研究酱油中米曲霉及其他微生物的成味脂肪酸分子代谢奠定了良好的基础。