模式微生物蛋白酰基化新修饰与代谢通路动态调控关系的探究

Lysine propionylation and malonylation are novel recently identified protein post-translational modifications (PTMs) identifiedrecently, which areevolutionarily conserved from bacteria to mammals.Although recent studies demonstrated the important roles of these new acyl modifications in mammalian physiology and pathology, the substrates and biological roles of propionylation and malonylation in prokaryotes are still poorly understood. In this project, we will use the mass spectrometry based proteomics approach to quantitatively analyze the global propionylation and malonylationsubstrates in the classical prokaryotic model organism Escherichia coli. We will systematically profile the dynamics of propionylation and malonylation substrates in response to different cellular environmentsand metabolic conditions associated with propionyl-coA or malonyl-CoA metabolisms to identify the key substrates involved in these pathways. We will further use the biochemical methods, such as mutagenesis and enzymatic activity assays, to validate mechanisms of the propionylation and malonylation substrates in regulation of these metabolic pathways. Using our previously reported acetylome and succinylome data, we will further investigate the relationships, distinct roles and cross-talks among these lysine acylation modificationsto provide a panoramic view of lysine acylation modifications in bacteria. This study will, for the first time,reveal the global substrates, the dynamic cellular networks, and regulatory roles of propionylation and malonylation in bacterial metabolism, which will provide a stepping stone for understanding the biologicalfunctions of these new lysine acylation modifications in bacterial physiology.

赖氨酸丙酰化和丙二酰化是近期发现在进化中保守的蛋白翻译后新修饰。近期研究证明此二修饰对高等动物的生理功能执行和疾病发生发展有密切联系，而对其在原核生物中的底物和生物学功能知之甚少。本项目拟以经典原核模式生物大肠杆菌为研究对象，采用基于最新生物质谱的修饰蛋白质组学分析策略，系统鉴定和定量分析与此二修饰供体辅酶A相关的不同细胞环境或代谢通路改变条件下的动态修饰底物，并利用生化手段确证关键底物在代谢通路调控中的作用。进一步利用生物信息学手段，分析不同赖氨酸酰化修饰间的关系和交互作用。此研究将系统揭示丙酰化和丙二酰化在细菌代谢通路中的底物、动态调控网络和调控机制，从而促进赖氨酸酰化新修饰在细菌中生理功能和病理机制的深入理解。

本项目以模式微生物大肠杆菌为研究对象，通过对细菌体内丙酰化、丙二酰化等翻译后修饰的系统性解析，阐述细菌中赖氨酸丙酰化和丙二酰化修饰的底物和参与细胞通路的全景，阐述丙酰化、丙二酰化修饰在相关能量代谢通路调控中的底物和作用机理，阐述丙酰化、丙二酰化等赖氨酸酰化修饰的底物和参加代谢通路调控功能异同。此外，为了系统性深入的解析翻译后修饰在细胞中的生物学功能和机制，我们对本项目研究拓展到了其它酰化修饰类型，并开发了一些翻译后修饰研究新技术。在本项目的支持下，我们取得了一系列的成果。包括：1) 我们首次绘制了耻垢分枝杆菌体内的丙酰化和乙酰化修饰谱，系统性揭示了丙酰化修饰和乙酰化修饰在细胞内的调控底物和网络，揭示了酰基转移酶MsKat的催化底物及特征。2) 我们对大肠杆菌细胞内丙二酰化修饰底物进行了系统性研究，发现细胞体内的丙二酰-CoA的高浓度积累不仅有助于提高赤松素的产量，同时也会造成细胞体内的丙二酰-CoA修饰引起的反馈调控。3）我们的工作揭示了酰化修饰在不同物种间的普遍性，揭示了酰化修饰在微生物次生代谢和细胞代谢调控方面的重要性。4) 我们对包括大肠杆菌、酿酒酵母和HeLa细胞等在内的原核生物及真核生物中甲基化修饰进行了系统性研究和对比，揭示了物种间甲基化修饰的多样性。5) 我们系统性研究了胰酶酶切二甲基化修饰赖氨酸特征，并对其酶切实验方法进行了优化。6) 我们开发了用于C端肽段高效、高特异性富集的LAACter方法。在我们的拓展工作中，我们开发了能够对开放搜索数据实现精准修饰类型解析和修饰定位的PTMiner数据分析程序。我们的工作系统解析了EZH2突变与不突变血液瘤细胞的甲基化修饰谱的差异。我们还系统性评估了不同无标定量策略定量的结果准确性和灵敏度。整体来讲，在本项目的研究成果最终系统性揭示了微生物体内包括丙酰化、丙二酰化在内的多种修饰类型的修饰谱，揭示了其修饰的特征，以及在生命活动中的生物学功能，同时拓展优化和发明了多项翻译后修饰研究技术，为蛋白质翻译后修饰的深入生物学功能研究提供重要资源和参考。