基于发酵中米曲霉氧化固醇结合蛋白探究大豆甾醇分子合成代谢路径

Soybean sterols are recently widely accepted as novel food resources with lowering serum cholesterol in the international food industry, which are produced by chemosynthesis, no paper report their synthesis from Microorganisms . Based on previous studies, one Aspergillus oryzae gene oxysterol binding protein (OSBP) is associated with soybean sterol synthesis, which has not been reported. This project focuses on cloning and expression OSBP gene from Aspergillus oryzae, Western blotting analysis and immunofluorescence localization, the objective is to explore the soybean sterols level in the ferment at different fermentation time-points and explore sterols transportation in various parts of A. oryzae mycelium at the sub-cellular level. Combined with the different types and levels of sterols during fermentation, we try to reveal tranport pathway of soybean sterols' molecules by metabolic synthesis in A. oryzae,which will provide clues to produce soybean sterol by microorganisms.

大豆甾醇是近年来国际认可的降胆固醇新资源食品，目前主要通过化学合成途径获得，未有生物合成的报道。前期研究发现，米曲霉含有的氧化固醇结合蛋白（OSBP）与大豆甾醇的生物合成密切相关。本研究拟克隆米曲霉氧化固醇结合蛋白（AoOSBP）的基因，实现其在大肠杆菌中异源高效表达。鉴定AoOSBP重组蛋白与大豆甾醇类物质的结合能力；制备抗体，通过Western blotting定量分析在不同发酵时期的AoOSBP的表达差异，结合半定量或实时定量 PCR，分析AoOSBP在米曲霉发酵不同时期AoOSBP表达水平与大豆甾醇的量效关系；经过免疫荧光共定位技术，显示在不同发酵时期AoOSBP米曲霉菌丝体的亚细胞区位，阐明在米曲霉发酵过程中大豆甾醇合成代谢的分子转运路径，为研究大豆甾醇合成代谢提供科学数据。

氧化甾醇结合蛋白是一类存在于真核生物体内结合氧化甾醇的保守蛋白。它具有参与细胞中脂类代谢、囊泡运输及信号传导等方面的重要功能，更重要的是大量研究表明这类蛋白具有能够结合氧化甾醇及植物甾醇的功能，本研究以来源于米曲霉3.042 的氧化甾醇结合蛋白为研究对象，主要进行了以下方面研究：.1 生物信息学分析结果表明米曲霉氧化甾醇结合蛋白（AoOSBP）是一个典型保守型蛋白。.2 运用了qRT-PCR、Western blot和免疫荧光法对不同生长时间米曲霉菌丝体中氧化甾醇结合蛋白从基因水平到表达水平进行了定性定量的分析。氧化甾醇结合蛋白在米曲霉生长的不同时期都具有高的表达量。.3 构建了两种表达载体pET-30a-osbp和pMAL-c4X-osbp-ord，分别表达了AoOSBP和米曲霉氧化甾醇结合蛋白的配体结合域蛋白（AoOSBP-ORD）。pMAL-c4X-osbp-ord载体表达的AoOSBP-ORD在诱导后表达量有明显的增加，并且通过直连淀粉酶柱纯化得到了高纯度的AoOSBP-ORDc重组蛋白。.4 运用微量热泳动技术对原核表达重组蛋白AoOSBP和AoOSBP-ORD的功能进行了分析。AoOSBP的结合实验结果表明，它具有结合麦角甾醇(Kd=74.338 nM)、25-羟基胆固醇(Kd=29.899 nM)、7-酮胆固醇(Kd=7.772 nM)、大豆甾醇(Kd=24.717 nM)、豆甾醇(Kd=32.469 nM)、菜油甾醇(Kd=20.328 uM)和β-谷甾醇(Kd=27.521 uM)的能力, 表明该蛋白对这些的底物都有很强的结合能力。AoOSBP-ORD对麦角甾醇、25-羟基胆固醇、7-酮胆固醇、大豆甾醇、豆甾醇有较强结合力，而对菜油甾醇和β-谷甾醇没有结合能力。.另外，本项目的研究还发现了另外四种OSBP的同源蛋白OSH。AoOSBP可以充当甾醇运输的一个载体，其结合底物氧化甾醇和植物甾醇对降低胆固醇有一定的作用，本项目的结果为进一步开发米曲霉氧化甾醇结合蛋白应用提供了科学数据。