基于S-核酸酶的新疆野生扁桃自交不亲和性泛素化特性的分子机制研究

Self-incompatibility is a widespread barrier to reproduction in flowering plants.When pollinated by non-self pollen, the style determinant S-RNase uptake by the pollen tube will be ubiquitinated and degraded by the 26S proteasome,leading to normal fertilization; while the self S-RNase would not be marked by ubiquitin and it will keep active and degrade the pollen tube rRNA,which leading to death of the pollen tube. Xinjiang wild almond(Prunus tenella) is the precious wild fruit tree resources, world-famous, On the basis of study the self-incompatibility response mechanism about S-Rnase, F-box and SSK1 gene. We will clone Ubiquitin Ligase E3- the components of the SCF complex SKP1, SBP1, Cullinl and F-box. Based on their expression patterns, We detected their interaction relationship and simulated the ubiquition system to determine whether the SCF complex could mediate the ubiquition of S-RNase. Research results help to establish and improve almond plant self-incompatibility model, Find out the mechanism , and it has been an important theoretical foundation about molecular and genetic basis of plant molecular breeding.

自交不亲和性是一种广泛存在于植物中的生殖隔离现象，在异花授粉条件下花柱S基因编码的S-RNase进入花粉管中，被花粉SCF复合体标记泛素并最终被26S蛋白酶体降解，从而导致异交亲和；而自我的S-RNase则不会被泛素标记，保持活性，降解花粉管的RNA，使花粉管生长受阻。新疆野生扁桃是我国珍贵的蔷薇科野生果树资源，我们在探讨其S-RNase、F-box及SSK1基因在自交不亲和反应中作用机制的前期研究基础上，进一步克隆E3泛素连接酶－SCF复合体相关组分SKP1-like，SBP1，Cullin1和F-box基因，探究组织和单元型特异性，深入验证其蛋白互作关系，探讨被花粉管吸收的S-RNase是否被泛素标记以及SCF复合体参与的体外模拟泛素化体系能否将S-RNase标记泛素。结果有助于建立完善扁桃类植物自交不亲和性模型，探明其自交不亲和性的机理，为该类植物分子育种奠定重要的分子与遗传学基础。

本研究以新疆野生扁桃为实验材料，利用RT-PCR，RACE等技术，克隆到新的自交不亲和PetCullin1基因(PetCUL1)和PetSBP1基因， 采用荧光定量实验分析PetCUL1, PetSBP1, PetSSK1, PetSFB等基因在不同组织部位间的表达差异性。研究表明，PetCUL1, PetSBP1基因在花瓣、花萼、花粉、花柱及叶部位均有表达，PetCUL1在花粉中表达量最高，而PetSBP1在花粉中表达量最低，PetSSK1，PetSFB基因在花粉组织中特异性表达，而在其他（花瓣、花萼、花柱及叶）部位不表达。. 酵母双杂交及pull-down实验分析揭示了PetSBP1，PetCUL1与PetSFB蛋白间的相互作用，此外，研究发现PetSSK1和PetCUL1之间存在弱相互作用，但PetSSK1并不与PetSFB存在相互作用，因此并无包含SSK1的SCF复合体。. PetSBPl连接的SCF复合体泛素标记S-RNase研究，首先，运用体外以及半体内的方法分析S-RNase的变化，研究发现S-RNase在花粉管内能够被泛素化。其次，模拟体内的泛素化体系，利用纯化蛋白人工构建SCF复合体，PetSBP1连接形成的SCF复合体在体外模拟的泛素化体系中，能够将S-RNase标记泛素。PetSBP1在复合体中起连接作用。随后对PetSSKl与S-RNase的泛素化也展开了研究，研究表明PetSSKl不能取代PetSBP1的作用连接PetCULl和PetSFB形成SCF复合体。. 研究表明新疆野生扁桃中有一种新的包含SBP1在内的SCF复合体模型，PetSBPl连接的SCF复合体泛素标记S-RNase研究表明被花粉管吸收的S-RNase可以被泛素标记，同时SCF复合体参与的体外模拟泛素化体系能够将S-RNase标记泛素，显示出配子体SI型新疆野生扁桃植物一种新的分子机制。