FoxO和ELP3调控赤拟谷盗Nrf2-Keap1信号通路及其靶标基因表达的分子机制

Nrf2-Keap1 signaling pathway is the key pathway that mediates responses to oxidative stress, and recent studies have discovered that this pathway plays an important role in the regulation of ecdysone biosynthesis in Drosophila. Up to now, studies on insect Nrf2/Keap1 signaling pathway mainly forcus on the identification of its downstream target genes,and there is no reports on the role of transcription factor and posttranslational modification in the regulation of Nrf2-Keap1 signaling pathway at home and abroad.The fact that both Forkhead box class O (FoxO) transcription factor and histone acetyltransferase Elp3 play important roles in insect oxidative responses and ecdysone biosynthesis suggests that these two genes might regulat Nrf2-Keap1 signaling pathway. In this project, by using real-time quantitative PCR, RNA interference, Western blot, Luciferase report gene assays, Chromatin immunoprecipitation, and other molecular biology techniques, we will comparatively analyze the pattern of Tribolium castaneum CncC and Keap1 genes regulating the oxidative stress- and ecdysone biosynthesis-related genes, and investigate the mechanisms regulating Nrf2-Keap1 signaling pathway and its target gene expression by FoxO and ELP3. The results of this project will provide novel insights into the molecular mechanisms underlying the action of insect Nrf2-Keap1 signaling pathway.

Nrf2-Keap1信号通路是细胞氧化应激反应中的关键通路。最近研究发现，该信号通路在调控果蝇蜕皮激素合成过程中也具有重要作用。目前国内外对昆虫Nrf2-Keap1信号通路的研究主要集中于其下游靶标基因的鉴定，尚无转录因子和翻译后修饰调控该信号通路的研究报道。叉头框转录因子FoxO和组蛋白乙酰转移酶ELP3在保护细胞抗氧化和蜕皮激素合成过程中也具有重要作用，提示这2个基因可能调控Nrf2-Keap1信号通路。本项目拟以赤拟谷盗为研究材料，应用定量PCR、RNA干扰、Western blot、荧光素酶报告基因和染色质免疫共沉淀等分子生物学技术，系统分析和比较赤拟谷盗CncC和Keap1基因对氧化应激和蜕皮激素合成相关基因表达的调控模式，探讨FoxO和ELP3基因对Nrf2-Keap1信号通路的调控机制。研究结果对于揭示昆虫Nrf2-Keap1信号通路作用的分子机制具有重要的科学意义。

Nrf2-Keap1信号通路在昆虫抗氧化应激、解毒代谢和生长发育等过程中具有重要作用，但目前对昆虫Nrf2-Keap1信号通路靶标基因的研究还相对滞后，并且尚无转录因子和翻译后修饰调控昆虫该信号通路的研究报道。本项目首先利用RT-PCR克隆获得赤拟谷盗甲硫氨酸亚砜还原酶基因TcMsrA和TcMsrB、硫氧还蛋白还原酶基因TcTrxR1和TcTrxR2、硫氧还蛋白基因TcTrx1、TcTrx2与TcTrx3以及磺基转移酶基因TcSULT1全长cDNA。RNA干扰实验发现，敲减TcMsrA和TcMsrB、TcTrxR1和TcTrxR2、TcTrx1、TcTrx2与TcTrx3导致对百草枯诱导氧化胁迫的耐受性显著降低，而敲减TcSULT1导致对溴氰菊酯的敏感性显著上升。在此基础上利用RT-qPCR、RNAi、双荧光素酶报告基因以及凝胶阻滞实验（EMSA）分析了TcCncC对于保幼激素（JH）与蜕皮激素（20E）信号通路以及抗氧化胁迫和解毒代谢相关基因的转录调控，发现TcPhantom、TcShade和TcJHEHr3、TcTrxR1和TcTrxR2、TcTrx1、TcTrx2和TcTrx3以及TcSULT1是TcCncC的下游靶标基因。进一步探讨了FOXO以及CncC-Keap1信号通路间的调控关系，发现TcFOXO敲减显著降低了TcCncC以及TcKeap1的mRNA和蛋白质水平，在Sf9细胞中过表达TcFOXO使得TcCncC的启动子活性上调至对照组的3.17倍，而对于TcKeap1的启动子活性没有显著影响，但TcCncC与TcMaf共表达时使TcKeap1的启动子活性上升至对照组的2.98倍。EMSA分析也显示在体外TcFOXO蛋白可以与TcCncC启动子区域结合，TcCncC蛋白可以与TcKeap1启动子区域结合。此外，还探讨了TcElp3基因对Nrf2-Keap1信号通路的调控，发现TcElp3干扰后TcCncC 和CncC-Keap1信号通路靶标解毒代谢相关基因表达水平显著下调，TcKeap1表达水平上调，并且干扰TcElp3基因后削弱了溴氰菊酯诱导的TcCncC核易位，导致对溴氰菊酯的敏感性上升。项目组较好地完成了计划任务，发表了6篇标注SCI收录论文，研究结果对于进一步揭示昆虫Nrf2-Keap1信号通路作用的分子机制具有重要的科学意义。