赤拟谷盗2种精氨酸激酶基因的功能与表达调控机制的比较分析

Phosphagen kinases (PKs) play key roles in cellular energy metabolism, among which arginine kinases (AKs) are widely distributed in invertebrates, protozoan, and bacteria, and have been proposed as potential molecular targets of innovative and highly selective insecticides. However, few studies have been conducted at home and abroad on the function and regulatory mechanisms for the expression of insect arginine kinase genes. Our previous studies have identified two arginine kinase genes, TcAK1 and TcAK2, in the genome of Tribolium castaneum, which belong to group 1 and group 2 insect AK families, respectively. In this project, by using real-time quantitative PCR, in vitro expression, RNA interference, Chromatin immunoprecipitation, and other molecular biology techniques, we will comparatively analyze the spatiotemporal expression patterns of TcAK1 and TcAK2 at different developmental stages and tissues, their enzyme characteristrics, the roles of TcAK1 and TcAK2 in development and response to adverse stress as well as the regulatory molecular mechanisms for the expression of TcAK1 and TcAK2. The results obtained from this project will not only assist in understanding the structure-function relationships of insect arginine kinases, but also provide important information for the development of novel insecticides as well as control of insect pests using transgenetic crops expressing dsRNAs specific to insect arginine kinase genes.

磷酸原激酶（PKs）在细胞能量代谢过程中起着关键作用，其中在无脊椎动物、原生动物和细菌中存在的精氨酸激酶（AKs）已成为开发新型高选择性杀虫剂的潜在靶标，但目前国内外关于昆虫精氨酸激酶的功能与表达调控机制的研究却相对滞后。本项目拟在前期研究首次发现赤拟谷盗基因组存在2种分别位于昆虫AK群1和群2的精氨酸激酶基因TcAK1和TcAK2的基础上，应用定量PCR、体外表达、RNA干扰和染色质免疫共沉淀等分子生物学技术，对TcAK1和TcAK2在赤拟谷盗不同发育阶段和组织部位的时空表达特性、TcAK1和TcAK2的酶学性质、TcAK1和TcAK2在赤拟谷盗适应逆境胁迫和生长发育过程中的作用及其表达调控的分子机制进行比较分析。研究结果对于进一步揭示昆虫AK基因的结构和功能具有重要的科学意义，同时也将为创制高选择性的杀虫剂以及利用表达AK基因dsRNAs的转基因作物控制害虫提供理论依据。

磷酸原激酶（PKs）在细胞能量代谢过程中起着关键作用，其中精氨酸激酶（AKs）不存在于哺乳动物中并且是昆虫体内唯一存在的磷酸原激酶，已成为开发新型高选择性杀虫剂的潜在靶标。本项目首先利用RT-PCR和RACE克隆了赤拟谷盗精氨酸激酶基因TcAK1和TcAK2全长cDNA。 时空表达模式分析发现，与22日龄幼虫相比，TcAK1基因在预蛹期表达水平显著下降，TcAK2基因在预蛹期表达水平显著上升；TcAK1和TcAK2基因都在头部和胸部表达水平最高。对重组TcAK1和TcAK2蛋白的酶学性质分析发现，TcAK1和TcAK2对L-精氨酸的特异性显著高于D-精氨酸，TcAK1对L-精氨酸（KmArg）和磷酸-L-精氨酸（KmP-Arg）的米氏常数分别为为1.5和1.4 mM,TcAK2分别为3.7和14 mM。实时荧光定量RT-PCR和 Western blot检测发现，高温（42℃）和低温（4℃）以及百草枯处理显著提高了TcAK1和TcAK2的mRNA和蛋白质表达水平。利用RNAi沉默TcAK1和TcAK2基因，发现dsTcAK1处理显著降低赤拟谷盗羽化率和产卵量，dsTcAK1和dsTcAK2处理显著减低赤拟谷盗卵孵化率以及对高温和百草枯的忍耐性。利用免疫荧光染色和western blot进行的亚细胞定位分析发现，TcAK1存在于包括线粒体在内的细胞质中，TcAK2位于除线粒体外的细胞质中。进一步研究发现，蜕皮激素负调控TcAK1的表达，正调控TcAK2的表达；保幼激素正调控TcAK1的表达，负调控TcAK2的表达；蜕皮激素和保幼激素通过昆虫特异性转录因子Broad-Complex（BR-C）调控TcAK1和TcAK2基因的表达。此外，研究还发现，Keap1/Nrf2信号通路正调控TcAK1和TcAK2基因的表达。项目组较好地完成了计划任务，发表了3篇标注SCI收录论文，研究结果对于进一步揭示昆虫精氨酸激酶基因的结构和功能关系以及新型高效杀虫剂的创制具有重要的理论意义和实践价值。