PGE2激活输尿管平滑肌cAMP信号通路参与输尿管排石的机制研究

Ureteral smooth muscle contraction and relaxation coordination exercise play a vital role in the expulsion of ureteral calculi. The research have attested that the vas deferens epithelium and airway epithelium inhibited adjacent smooth muscle contraction by releasing PGE2. We found that there were a large number of PGE2 expression in the normal rat ureter by metabonomics analysis in our pre-experimental, but whether PGE2 is involved in the regulation of ureteral diastolic balance? Furthermore, we found the expression of PKA in the downstream target protein was down-regulated by RT-PCR and Western blot analysis in SD rat urinary calculi model. Therefore, we hypothesized that “in the calculus stimulation, PGE2 secretion decreased, and caused cAMP/PKA signaling pathway disorder, accordingly leading to ureteral smooth muscle contraction/diastolic imbalance”. We intend to use stone animal model, modern electrophysiology, cellular biology and other experimental techniques to acquire the reliable evidence of epithelial cell damage which by the stone stimulation leading to decreased PGE2 secretion and the cAMP/PKA signal pathway disorder from the cell-tissue-the overall animal level, which ultimately lead to ureteral smooth muscle contraction/diastolic dysfunction. This study could provide the scientific basis for the new treatment of ureteral calculi.

输尿管平滑肌的收缩与舒张协调运动在输尿管结石排石过程中发挥着重要的作用。已有研究证明输精管上皮与气道上皮可通过生成PGE2抑制平滑肌的收缩，从而调控平滑肌收缩舒张平衡。我们通过输尿管组织的代谢组学预实验检测，发现正常大鼠输尿管存在着PGE2的生成。但PGE2是否参与输尿管舒张平衡调节？我们进一步在SD大鼠尿路结石模型中，发现PGE2通路下游靶蛋白PKA表达下调。据此，我们提出“结石刺激将阻碍PGE2合成，引起cAMP/PKA信号通路紊乱，从而导致输尿管平滑肌收缩/舒张失衡”的假设。拟通过结石动物模型，采用现代电生理、细胞分子生物学等实验技术，从细胞-组织-整体动物水平，获得结石刺激下上皮损伤引起PGE2分泌减少导致cAMP/PKA信号通路紊乱的可靠证据，有望揭示输尿管平滑肌收缩/舒张平衡失调的作用机制，为临床输尿管排石新治疗提供可靠的科学依据。

本项目探究输尿管平滑肌中前列腺素E2 (prostaglandin E2,PGE2)及其受体结合对输尿管收缩/舒张时结石排除的生物学效应，为PGE2作为促排石生物分子提供新的理论依据及为输尿管结石治疗提供新的思路。我们通过免疫荧光和WB技术确定输尿管肌纤维细胞中E2受体的表达情况及位置，进一步使用离体输尿管模型进行PGE2及EP受体阻滞及激动条件下的张力实验验证其生物学功能；并通过构建兔的动物实验模型，收集术后不同时间的输尿管组织进一步验证EP受体表达情况及PGE2含量水平，进一步证实其在完全梗阻模型中输尿管的收缩/舒张的生物学功能。Western blot结果提示输尿管平滑肌细胞表达前列腺素E2受体2（Prostaglandin E2 receptor 2，EP2）和前列腺素E2受体4（Prostaglandin E2 receptor 4，EP4），免疫荧光提示EP2定位在细胞膜；EP4定位在细胞核。通过家兔离体输尿管张力实验，我们发现PGE2能呈浓度依赖性舒张高钾诱发的输尿管组织收缩EC50为2.253×10-7 M，加入EP2受体拮抗剂后，舒张效应消失，提示该舒张由PGE2与EP2结合引发。动物实验部分，影像学提示家兔下腹部存在高密度影，解剖可观察输尿管结石存在于输尿管管腔中，且为不完全梗阻模型。离体组织WB提示，在正常家兔输尿管中EP2在输尿管各个部位蛋白表达量无明显差异（P＞0.05）。在不同天数左侧上段输尿管中EP2蛋白表达经方差分析，具有统计学意义（F=52.51，P＜0.000），且在术后第3天表达量最高，随着时间增加有下降趋势。在不同天数左侧上段输尿管中膜结合型前列腺素E2合酶-1（ microsomal prostaglandin E synthase-1，mPGES-1）蛋白表达经方差分析具有统计学意义（F=228.9，P＜0.000），在术后第1天表达量最高，随后逐渐下降。综上所述，在输尿管组织中，PGE2可通过与平滑肌上的EP2受体结合，产生舒张输尿管的效应。在输尿管结石模型中，PGE2通过与输尿管平滑肌EP2受体结合，梗阻状态下的PGE2合成增加及EP2受体蛋白表达增加实现输尿管舒张的生物学功能，成为结石排除的有利因素。