膀胱输尿管反流重要基因Robo2调控输尿管发育的关键机制

膀胱输尿管返流（VUR）可致严重的泌尿系统及肾功能损伤。我们发现ROBO2突变引起病人VUR，被命名VUR2基因。在此基础上构建的Robo2敲除小鼠出现输尿管膀胱入口异常、扩张导致VUR。最近我们证实Robo2表达于后肾间充质和远端输尿管膀胱区。本研究拟通过正负调控胚胎后肾间充质Robo2，与Wolffin duct细胞共培养，研究Robo2是否使此细胞定向迁移萌出输尿管芽？在远端输尿管区过表达或敲除Robo2，研究它在膀胱区表达进而调控整个输尿管发育及生理功能的作用。利用Robo2敲除小鼠，以输尿管基因筛查、酵母双杂交等手段，探讨Robo2在输尿管发育的关键分子调控机制。通过挽救实验，调控关键信号分子，矫正发育缺陷。从而该研究将证实Robo2通过细胞定向迁移萌出单一输尿管；并且整个输尿管发育是受远端输尿管膀胱区Robo2调控的新观点，进而阐明VUR关键基因致病机制，为临床治疗提供新思路。

膀胱输尿管返流（VUR）可致严重的泌尿系统及肾功能损伤。ROBO2 突变引起病人VUR，被命名VUR2 基因。在此基础上构建的Robo2 敲除小鼠出现输尿管膀胱入口异常、扩张导致VUR。但是ROBO2导致输尿管发育异常的分子机制并不清楚，因而我们从Robo2在肾脏输尿管膀胱发育过程的时空表达；Robo2基因过表达引起的肾脏发育异常以及Robo2基因缺陷导致输尿管发育异常三个方面进行了研究，取得了预期研究结果。.（1）本研究首先发现Robo2在小鼠肾脏发育各阶段均有不同程度的表达。在发育的E12.5d～E14.5d表达水平最高，随后明显下降，出生后维持在低水平表达，生后5w表达量最低。Robo2最初表达在胚肾的后肾间充质，而非输尿管芽（UB）。随着肾脏发育，表达于帽状间充质、逗号形体和“S”形体以及肾小球毛细血管袢，最终表达于肾小球足细胞。研究了Robo2在肾脏发育过程的时空表达特性，首次证实Robo2在膀胱区表达。（2）Robo2基因过表达引起的肾脏发育异常：利用Robo2基因表达载体电转化小鼠胚胎过表达Robo2，均可出现输尿管芽分支减少，肾小球数目降低，与基因敲除模型表型相似。提示Robo2为正常肾脏发育所必需, Robo2过度表达可以引起体外培养的肾脏UB分支减少，肾小球数量减少。其机制并不是由于直接影响UB上皮细胞，而是通过使UB头端的帽状间充质细胞聚集减少间接抑制UB的分支，并且帽状间充质细胞聚集减少与凋亡和增殖无关，可能与Robo2的引导作用有关。发现Robo2过表达引起后肾间充质细胞聚集减少，导致肾脏发育缺陷的新机制。（3）Robo2基因缺陷导致肾脏输尿管发育异常：Robo2敲除小鼠出现明显肾脏和输尿管发育异常，包括多个肾脏，胚胎期肾脏体积小，多个输尿管，输尿管扩张，输尿管长度变短，输尿管口与膀胱连接异常。这些结果说明Robo2可调控输尿管发育。通过基因转录组检测，研究分析了Robo2基因敲除后输尿管的转录本变化，结合基因组学技术，初步绘制了Robo2调控肾脏输尿管发育的分子网络。并利用筛选的关键分子视黄酸进行了挽救实验。. 通过本项研究，我们提出整个输尿管发育是受远端输尿管膀胱区Robo2 调控的新观点，进而阐明VUR关键基因致病机制，为临床治疗提供新思路。