新的细胞自噬相关基因TMEM74的作用机制研究

TMEM74（Transmembrane protein 74）基因是本实验室在国际上首次证实与细胞自噬相关的人类新基因。我们初步的研究结果发现TMEM74定位于细胞的溶酶体和自噬泡，其在细胞内的超表达能够诱导细胞发生自噬，抑制其内源性基因表达可以抑制饥饿诱导的细胞自噬。相关功能的文章已经发表在BBRC上。本课题将借助于生物信息学、分子生物学、细胞生物学、siRNA技术、酵母双杂交、免疫共沉淀、蛋白质组学等技术，深入探讨TMEM74的分子结构和功能，研究TMEM74对细胞凋亡以及细胞自噬的双重调控作用以及相互作用关系，阐明TMEM74作用的分子机制和信号转导途径，鉴定出相互作用的蛋白分子,为TMEM74 潜在的临床应用奠定基础。

获得了资金资助后，在原有的工作基础上，利用间接免疫荧光技术进一步确定了内源性的TMEM74的亚细胞定位。建立和完善了检测TMEM74引起细胞自噬和细胞凋亡的形态学和生化指标。我们观察了TMEM74超表达对溶酶体的效应，检测了cathepsin B的表达水平以及释放情况，并用siRNA技术敲减cathepsin B，观察了细胞的变化情况。对线粒体的功能进行了检测，观察了敲减TMEM74对细胞凋亡和自噬的影响。我们应用了caspase3的抑制剂抑制了caspase3的活性，然后超表达了TMEM74，证明TMEM74诱导的细胞死亡不是caspase依赖的，而是自噬性的细胞死亡。接着我们对TMEM74的作用机制进行了研究。我们研究了TMEM74的相互作用分子，首先通过酵母双杂交寻找其相互作用分子，我们找到了Bik可能和TMEM74的相互作用分子，接着对其目标分子进行了进一步验证，通过激光共聚焦显微镜和免疫共沉淀实验初步验证了与TMEM74的相互作用分子，并对它们在功能上的相互作用进行了检测。. 在项目的完成过程中基本是顺利的，但是在TMEM74文章的发表过程中不是很顺利。目前仍在投稿中。在该项基金的资助下，我们目前共发表了2篇文章，分别是发表在细胞与分子免疫学杂志上的“人类新基因CTRP4的原核表达及多克隆抗体的制备 ”和发表在Cancer Letters上的"Identification of C1qTNF-related protein 4 as a potential cytokinethat stimulates the STAT3 and NF-jB pathways and promotes cell survival in human cancer cells".