葡萄果实糖积累过程中己糖激酶基因功能表达及对植物激素信号的响应

本研究目的通过对酿酒葡萄果实中己糖激酶基因的克隆与序列测定,经相关软件分析，推测氨基酸组成与序列，并与其它植物的同源性进行比对。对己糖激酶蛋白的N端可变域，激酶域等的结构特征进行分析。同时，利用原核体外表达蛋白分子生物学技术，采用镍亲合层析分离和纯化带有多聚His标签的蛋白，纯化后检测蛋白纯度和亚基组成。将体外表达纯化后的酶蛋白与从葡萄果实中直接提取己糖激酶蛋白进行比对。确立己糖激酶蛋白功能结构，从而进一步研究己糖激酶在葡萄果实中糖积累中的分子机制。为了阐明己糖激酶的糖感知信号转导途径以及与激素信号转导途径的联系机制,本研究还进行了果实发育不同时期己糖激酶的表达差异与内源ABA、IAA、GA3浓度的相关性。同时，应用外源ABA、IAA、GA3温育葡萄果实圆片，验证己糖激酶是否参与了植物的ABA信号转导过程。阐明激素调控和己糖激酶介导的糖积累交互作用(crosstalk)分子机制。

本项目以‘赤霞珠’葡萄果实为试材，利用生物技术在基因水平、蛋白质水平及酶水平分别对HXK进行了研究，结果表明：两个全长的HXK cDNAs，VvHXK1和VvHXK2被克隆。经DNAMAN分析表明，VvHXK1和VvHXK2编码的蛋白质具有己糖激酶特征结构域。‘赤霞珠’葡萄浆果中VvHXK1和VvHXK2基因序列分别登记在GenBank，登记号分别为JN118544和JN118545。该HXK蛋白成功表达在大肠杆菌BL21（DE3）pLysS的质粒pET-30a +）载体中。所表达的蛋白使用Ni-NTA琼脂糖柱纯化，并生产HXK1抗体，进行HXK蛋白印迹分析。在葡萄浆果中检测到一条分子量约51 kDa的HXK多肽带。研究了不同时期果实HXK蛋白变化规律：在幼果期，HXK蛋白表达最高，但是在葡萄果实发育50-60d间最低，HXK蛋白表达逐渐降低。发育进入转色期，HXK蛋白表达又呈升高趋势。对HXK的两个同工酶的生化分析表明，葡萄糖是HXK的最适底物，这两个同功酶的等电点分别为5.8和5.6。最适pH约为8.0。这些结果为进一步研究葡萄HXKs调控葡萄浆果糖含量提供理论依据。.本研究以酿酒葡萄‘赤霞珠’当年生果实为试材，使用HPLC法测定糖及激素含量，使用半定量RT-PCR法测定己糖代谢关键酶己糖激酶转录水平的表达量，对激素调控糖含量及激素对己糖激酶基因表达的调控进行了分析，为激素用于改善果实品质提供理论依据。结果表明，成熟的葡萄果实以积累己糖（葡萄糖和果糖）为主，葡萄浆果发育过程中IAA、GA3、ABA的含量均先下降后上升，之后又下降的趋势。己糖激酶在幼果期呈现较高的mRNA水平，花后50天到花后70天呈现较低的mRNA水平，之后其表达量又有所增加。这些现象说明三者之间的可能存在相互作用的关系。ABA低浓度诱导HXK1，低浓度抑制HXK2，高浓度基本无明显变化，对SuSy1、SuSy2的抑制作用随着浓度的增加而增大，诱导CWINV基因表达。葡萄糖胺可以降低ABA或GA3对基因的抑制作用。ABA 或GA3和糖共同处理对糖代谢关键酶基因表达有增效作用。