酿酒葡萄果实发育过程中蛋白激酶SnRKs调控糖积累的分子机制

The sugar contents of wine grape berry play a decisive role in wine quality. So the regulation of sugar accumulation in grape berry is essential. Sucrose non-fermenting related protein kinases (SnRKs) are important signaling molecule in perceiving sugar level and determine the carbon assimilates synthetic and transport capacity. SnRKs play a critical role in the regulation of sugar accumulation process. Wine grape 'Cabernet Sauvignon' berry will be used as test material in the present research. The modern molecular biotechnology and the yeast two-hybrid technology will be used to screen specific gene expression during SnRKs protein kinase-mediated glucose and ABA signal transduction pathways. The SnRKs genes will be cloned, phylogenetic trees will be constructed and its functions will be predicted. SnRKs protein subcellular localization will be doing by using SnRKs-GFP fusion protein expression technology to determine SnRKs protein in the fruit cells functional sites. SnRKs gene family-specific expression will be detected in the transcriptional and translational levels. The T-DNA insertion mutations and overexpression transgenic cell lines will be obtained to explore the functions of SnRKs family respectively in glucose regulation and ABA regulation signal path during fruit sugar accumulation. The synergy function of SnRKs family in the hexokinase-mediated sugar signal path and the SnRKs involved molecular regulation of sugar accumulation in wine grape will be revealed in the present research.

酿酒葡萄果实的糖含量对葡萄酒品质起决定性作用，因此，葡萄果实糖积累的调控至关重要。蔗糖非酵解型蛋白激酶（SnRKs）是感知糖水平和决定碳同化物合成和转运能力的重要信号分子，在调节糖积累过程中发挥着关键作用。本研究以酿酒葡萄'赤霞珠'果实为试材，运用现代分子生物技术和酵母双杂交技术筛选SnRKs蛋白激酶介导的葡萄糖和ABA信号转导途径中特异表达的基因，对SnRKs基因家族进行基因克隆、构建系统进化树及预测其功能。利用SnRKs-GFP融合蛋白表达技术进行SnRKs蛋白的亚细胞定位，确定SnRKs蛋白在果实细胞中的功能部位。检测SnRKs基因家族在转录和翻译水平上的特异性表达，构建T-DNA插入突变和过表达SnRK的转基因细胞系,探究SnRKs家族分别在葡萄糖调节和ABA激素调节果实糖积累信号路径中的功能以及与己糖激酶介导的糖信号路径之间的协同作用，揭示SnRKs介导果实糖积累的分子调控机制。

目前，国内外广泛研究葡萄果实的生长和成熟规律以了解影响果实品质的生理生化因素。葡萄浆果积累很少量的蔗糖，但积累大量的葡萄糖和果糖。在酿酒过程中，葡萄果实中的糖含量对葡萄酒的品质和风味起着重要的作用。因此，提高酿酒葡萄果实的含糖量，研究糖信号具有十分重要的意义。在植物中，SNF1相关激酶1（SnRK1）对碳水化合物和淀粉代谢起着重要的作用。然而，在酿酒葡萄果实发育中，对SnRK1参与调节糖代谢相关的关键酶以及糖与激素信号介导SnRK1相互交叉调控糖代谢目前还没有报道。因此，本研究选作酿酒葡萄赤霞珠果实为试验材料，从中克隆了23种SnRKs蛋白激酶，并进行了生物信息学分析。同时测定了23 种蛋白激酶SnRK基因在葡萄果实不同发育时期的表达情况。此外，对葡萄SnRK1.1 和SnRK1.2蛋白进行纯化，并制作了抗体。利用这两种抗体进行了葡萄SnRK1.1 和SnRK1.2免疫亚细胞定位，显示它们主要分布在细胞质、液泡和细胞核。还利用它们用免疫印迹法检测了酿酒葡萄赤霞珠果实不同发育时期的蛋白表达情况。另外，为了验证蛋白激酶SnRK1.1 和SnRK1.2在葡萄果实糖代谢中的作用，我们分别在葡萄愈伤组织和野生型拟南芥生态型哥伦比亚叶片中导入这两种基因，以及在葡萄愈伤组织中沉默的这两种基因。然后，探索在葡萄果实糖积累过程中，SnRK1.1 和SnRK1.2分别在糖与激素两种信号以及这两种信号之间的相互作用中起着怎样的作用。同时，还做了葡萄愈伤组织中过表达的这两种基因以及葡萄SnRK1.1 和SnRK1.2转入SnRK1突变体拟南芥AKIN10中作为研究对照。分别对葡萄愈伤组织和拟南芥野生型和转基因型进行糖和ABA处理。我们的研究结果表明，SnRK1.1 和SnRK1.2表达改变了ABA、葡萄糖、果糖和蔗糖的积累。SnRK1.1 和SnRK1.2过表达上调SuSy、SPS和ABA应答基因ABI3的表达，同时下调CWINV，CINV和VINV表达。ABA和蔗糖信号交叉促进SuSy表达，而ABA可以弥补葡萄糖的抑制作用。然而，葡萄糖必须先磷酸化后与ABA信号交叉上调HXK，SPS和ABI3的表达。总之，这些结果表明：Glc，蔗糖和ABA信号以及糖和ABA的交叉调节蔗糖代谢，确认了葡萄SnRK1蛋白激酶在调节糖代谢中的作用。