鸭坦布苏病毒经鼻腔感染并致死哺乳动物模型的分子基础

Duck Tembusu virus (DTMUV), a member of the Ntaya group within the genus Flavivirus, has caused great economic loss to the poultry industry in China. Many known flaviviruses could induced severe diseases in humans, moreover high percent of DTMUV-positive antibody have been detected in humans. Therefore, the study on pathogenicity of DTMUV infection in mammals is becoming a great significance to public health. Previous data have indicated most of DTMUV strains couldn’t kill mice after inoculated intranasally. When we purified DTMUV by limited dilution, we isolated a virulent strain which is lethal to mice infected intranasally. In this research, we will use site-mutaions and reverse genetics techniques to rescue site-mutation viruses based on two different pathological strains to mice. The key amino acid mutations determing viral lethal intranasal infection in mice will be identified in vivo. Furthermore the biological characteristics, receptor binding capacity of the key site-mutation viruses will be thoroughly assessed in vitro. Finally, the mechanism of key amino acid determining the invasion of center nervous system will be explored. In this project, the molecular basis of lethal intranasal infection of DTMUV in mice will be clarified, which will provide insight into the pathogenesis of flaviviruses infection in mammals.

新发鸭坦布苏病毒（DTMUV）给中国的养鸭业造成了巨大的经济损失。由于该病原所属的黄病毒属病毒大多具有感染人的能力，而且已有从人血清中检测到DTMUV抗体的报道，因此研究DTMUV对哺乳动物的致病性具有重要的公共卫生学意义。前期研究发现大多数DTMUV是不能通过鼻腔感染并致死小鼠，通过有限稀释法纯化DTMUV时，我们获得一株可以经鼻腔感染并致死小鼠的病毒株。本项目拟根据前期研究发现对小鼠具有不同致病力的病毒株，采用定点突变和反向遗传操作技术拯救定点突变病毒株。通过动物试验确定对小鼠的致病力有影响的氨基酸位点；利用体外实验检测这些氨基酸位点改变对DTMUV生物学特性和受体结合能力的影响；进一步探索这些氨基酸位点改变导致DTMUV进入小鼠中枢神经系统的机制。研究结果将阐明DTMUV通过呼吸系统感染哺乳动物的分子机制，丰富了黄病毒对哺乳动物的致病机理研究。

鸭坦布苏病毒对哺乳动物的致病性研究具有重要的公共卫生学意义，我们前期研究表明E 蛋白的326位点（E→K）、NS3 蛋白的519 位点（A→T）氨基酸的改变对DTMUV 经鼻腔感染小鼠起重要作用。经过本研究的开展，利用反向遗传操作系统成功救获了rFX-E（E326K）、rFX-NS3（A519T）和rFX-E（E326K）NS3（A519T）三株重组病毒株（点突变病毒），并在此基础上对三株重组病毒进行小鼠致病性实验，结果表明重组病毒经鼻腔感染小鼠的能力不同，其中E（E326K）和NS3（A519T）突变均与病毒经鼻腔进入脑中增殖有关，而rFX-NS3（A519T）与亲本毒rFX2010经鼻腔接种小鼠后不能引起小鼠体重下降和死亡，单独或同时包含E蛋白326位突变的病毒rFX-E（E326K）和rFX-E（E326K）NS3（A519T）经鼻腔感染小鼠后，可以引起部分小鼠体重下降并最终死亡，由此阐明了导致DTMUV纯化毒经鼻腔感染并致死小鼠的关键位点为E蛋白第326位谷氨酸（E）突变为赖氨酸（K）。同时为了研究DTMUV纯化毒由鼻腔进入脑组织的扩散路径，我们用5% ZnSO4溶液对小鼠进行灌鼻处理后，对小鼠进行鼻腔感染实验，发现嗅上皮细胞(olfactory epithelium, OE)被破坏后，攻毒组小鼠死亡率减小，死亡时间延迟，由此证明了DTMUV纯化毒是通过OE进入脑中扩散并最终导致小鼠死亡的，该研究初步阐明了DTMUV通过呼吸系统感染哺乳动物的分子机制。