突触黏附分子β-neurexin和neuroligin 1在蛛网膜下腔出血后认知障碍中的作用机制研究

Cognitive impairment after subarachnoid hemorrhage (SAH) is an important factor affecting the prognosis of patients. The mechanism is unknown at present. Neuronal transmission relies on signals transmitted through a vast array of excitatory and inhibitory neuronal synaptic connections. There is a wealth of evidence suggesting that cell adhesion molecules provide much of the information required for synapse formation. This project focused on exploring the roles of synaptic adhesion molecules β-neurexin and neuroligin 1 in cognitive impairment after SAH. Firstly, we try to discover the mechanism in cell. Gene transfection and RNAi are used to regulate the target genes expression, and then to understand synaptic morphology, ultrastructure, and electrophysiological characteristics change. Secondly, in brain slice from different genetic backgrounds, we use patch-clamp technique to study LTP change in hippocampus C1-C3 areas and dentate gyrus pathways. Finally, SAH model is established in transgenic mice and drug treated rats, and then we observe the changes of synaptic function, synapsis quantity, and LTP, and assess the cognitive impairment. The longitudinal studies from three levels of cell, tissue and in vivo, horizontal researches from three levels of ultrastructure, electrophysiology and molecular biology in this study will provide us new ideas and theoretical basis to improve the prognosis of SAH.

蛛网膜下腔出血（SAH）后认知障碍是影响预后的重要因素，发生机制不明。突触及其可塑性是形成认知的基础，突触之间的信号传递依赖于突触黏附分子的互相作用，本研究着重探索突触黏附分子β-neurexin（主要位于突触前膜）和neuroligin 1（主要位于突触后膜）在SAH后认知障碍中的作用。第一部分围绕细胞层面展开，在SAH体外模型中，通过基因转染和RNAi调控目标基因，结合单细胞膜片钳技术，了解神经元突触形态学、超微结构、电生理改变；第二部分围绕组织层面展开，通过活体脑片膜片钳技术，结合基因调控，评估海马神经通路长时程增强（LTP）；第三部分围绕活体动物SAH模型展开，应用转基因和siRNA干预等方法，观察突触功能、数量，以及LTP的变化，检测认知障碍的程度。本研究纵向从细胞、组织和活体三个层面，横向从超微结构、电生理和分子生物学三个层面开展研究，将为改善SAH预后提供新思路和理论依据。

突触黏附蛋白Neurexin-1β及Neuroligin-1在突触结构的形成，维持和调节中发挥重要作用。本课题旨在研究突触黏附蛋白Neurexin-1β及Neuroligin-1在蛛网膜下腔出血（SAH）后认知损伤中的作用。第一部分，分别在大鼠SAH后3h、6h、12h、24h、48h、72h、1w、2w处死大鼠。所有大鼠均进行体循环灌注，并取大脑皮层、海马组织做标本，进行Western blot及免疫荧光分析neurexin-1β及neuroligin-1的蛋白水平。第二部分，大鼠随机分为五组：假手术组、SAH组、scramble siRNA组、neurexin-1β siRNA组、neuroligin-1 siRNA组，进行神经功能评分和Morris水迷宫试验，测试大鼠认知功能改变。第三部分，利用neurexin-1β及neuroligin-1的siRNAs和过表达质粒转染原代神经元细胞，24h后以20μM 氧合血红蛋白刺激神经元24h，然后进行western blot和免疫荧光分析。与假手术组相比，SAH后3h~24h大鼠脑皮质中 neurexin-1β及 neuroligin-1的蛋白水平明显降低，SAH后24h~72h蛋白水平降低最为明显，2w组的蛋白水平与假手术组比较无统计学差异；与假手术组相比，SAH组大鼠神经功能下降；与SAH组相比，neurexin-1β siRNA组和neuroligin-1 siRNA组大鼠神经功能显著下降；与对照组相比，氧合血红蛋白处理组中neurexin-1β及neuroligin-1的蛋白水平显著下降，类突触结构也明显减少； neurexin-1β及neuroligin-1过表达可以显著抑制氧合血红蛋白诱导的类突触结构减少。综上说明，neurexin-1β及neuroligin-1蛋白水平下降可能是SAH后行为学功能下降的重要原因，适度提高neurexin-1β及neuroligin-1的蛋白水平可能有利于缓解SAH后脑损伤。