Clathrin介导的内吞——线粒体膜脂质来源的探讨

内吞作用是指细胞膜内陷后将胞外物质运入胞内的过程，先后有细胞膜、胞饮（吞）泡，早期吞噬体、晚期吞噬体、溶酶体，特殊情况下还有跨高尔基网络和内质网的参与，但从未见有线粒体参与的报道。我们在利用不透膜的脂类荧光染料FM dye孵育细胞时，意外发现染料可以标记出线粒体。预实验表明可能在多种细胞中都存在一条由clathrin介导的从细胞膜到线粒体膜的脂质内吞途径，而且这条途径不需要经过吞噬体和溶酶体步骤，似乎是内陷的细胞膜形成小囊泡后直接运输到线粒体。我们相信本研究将深化对内吞作用的认识。线粒体具有重要的功能，然而有关线粒体膜的脂质成分来源和运输途径却未有定论，本研究有可能提出新的观点。线粒体与凋亡，神经退行性疾病，急慢性中毒，衰老等多方面有着重要联系，研究线粒体内吞现象在其中的意义将是很有意思的问题。我们的预实验也发现在神经退行性疾病Niemann-Pick C1中，线粒体内吞脂质的过程有改变。

线粒体存在于大多数真核生物细胞中，是细胞内唯一存在于细胞核外又带有遗传物质的细胞器，具有生成ATP，参与凋亡，自由基的生成等重要功能，与神经退行性疾病，急慢性中毒，衰老等多方面有着重要联系。线粒体膜是特殊的双层结构，主要由脂质和蛋白质组成。线粒体本身几乎不能合成脂类和蛋白质，主要依靠在核糖体和内质网中合成后经转运而来。一般而言，内质网合成后的膜脂以膜泡运输的方式转运至高尔基体，溶酶体和质膜上，或借磷脂转移蛋白形成水溶性复合物，转至其他膜上。然而构成线粒体膜的脂质在内质网合成后到达线粒体的转运途径目前并不清楚，有包括胞内直接扩散；磷脂转移蛋白形成水溶性复合物转移；胞内小囊泡运输和通过内质网膜和线粒体膜转移接触等多种猜测。在本课题中，通过相关的实验结果，我们认为线粒体膜脂质的来源还可能存在一条新的途径：⑴细胞膜内陷⑵胞内小囊泡运输⑶小囊泡膜和线粒体膜融合。 . 我们利用不透膜的脂类荧光染料FM（FM 2-10，FM 4-64，AM 1-43）孵育细胞，通过质粒转染，免疫组化，多染料活细胞实时观察，荧光共振能量转移等技术，证实脂类染料FM可以通过clathrin介导的内吞途径分别进入溶酶体和线粒体。有意思的是，FM 染料进入溶酶体的途径是经典的⑴细胞膜内陷⑵形成胞饮或胞吞小泡⑶小囊泡融合早期吞噬体⑷融合晚期吞噬体或溶酶体；而FM 染料进入线粒体的过程是不一样的途径，我们利用多种手段（包括突变质粒和药物等）来破坏早期吞噬体、晚期吞噬体或溶酶体的功能，发现会干扰FM 染料进入溶酶体但不干扰FM染料进入线粒体。利用微电极胞内显微注射，活细胞实时记录光漂白恢复及药物处理等手段，我们发现FM染料进入线粒体的过程是FM标记的小囊泡依赖微管蛋白主动运输到线粒体，然后囊泡膜与线粒体膜发生融合。. FM染料标记线粒体的现象提示线粒体参与了膜脂质的内吞。然而 FM 染料是一种外来的人工物质，并不是细胞膜的组成部分，因此寻找细胞膜本身的脂类成分验证这一内吞途径经显得十分重要。目前脂类研究中很多指示剂本身是脂溶性的，这给研究内吞带来了不利的条件，我们曾试图和相关试剂公司联系，制备一些不能跨膜的类似膜固有脂类的指示剂来进行研究，但受制于经费和技术，进展很慢，缺乏这部分内容也是本研究工作目前尚未发表的主要原因。我们更希望能证明线粒体参与脂质内吞是一种生理现象.