不同亚型NOS介导KCC2-GABAA受体通路在脑缺血致皮质神经元损伤中的作用

Nitric oxide synthase (NOS)-mediated oxidative stress and K+-Cl- co-transporter 2 (KCC2)-regulated Gama-aminobutyric acid (GABA) A type receptor (GABAAR) signaling pathway play important roles in the damage of cortical neurons. Whether the two signaling pathways regulate each other in brain ischemia remains unknown. Our previous studies showed a neurobehavioral alteration and, changes in the expression level of GABA and neuronal morphological structure in the rat after brain ischemia, suggesting a highly-correlation between GABA signaling and neuronal damage. Here, we aim at investigating how the temporal-spatial expression of different subtypes of NOS regulates KCC2-GABAA receptor signaling pathway by employing in vivo brain ischemia rat models and in vitro oxygen-glucose deprivation-induced model. Targeting on the regulatory networks consist of the two signaling pathway, we plan to use NOS inhibitor, KCC2 agonists, and GABAAR agonists to explore whether they can lessen the symptoms of neuronal damage of cortical neurons in the diseased models. Our study provides evidences for explaining pathology of brain ischemia and identifying drug targets for the clinical treatments.

一氧化氮合酶（NOS）介导的氧化应激以及K+-Cl-共转运体2（KCC2）调控的γ-氨基丁酸A受体（GABAAR）通路在脑神经元损伤中起到重要的作用，二者是否在脑缺血诱导的神经元损伤过程中存在相互调控作用尚属未知。本研究团队的前期实验结果发现缺血性脑损伤可引起大鼠神经行为学以及皮质区神经元形态结构与GABA含量改变，指示GABA信号通路与神经元损伤存在一定的联系。因此，本项目拟以NOS、KCC2-GABAAR信号通路为切入点，基于在体缺血性脑损伤模型和体外缺糖乏氧诱导模型，分析不同亚型NOS对KCC2-GABAAR信号通路的时空调控作用；并针对上述相互调控网络，使用NOS抑制剂以及KCC2和GABAAR激动剂，检测其是否可缓解疾病模型中神经元损伤状况。本项目将为阐明缺血性脑损伤的病理机制、寻找临床治疗的新靶点提供可靠的理论和实验依据。

脑缺血损伤的病理过程极其复杂，涉及兴奋性毒性、氧化应激、细胞凋亡及炎症反应等一系列分子事件。已有报道，一氧化氮合酶（NOS）介导的氧化应激以及K+-Cl-共转运体2（KCC2）调控的γ-氨基丁酸A受体（GABAAR）通路在神经元损伤中起着重要的作用。为深入揭示脑缺血损伤的病理机制，本项目聚焦NOS、KCC2/GABAAR信号通路的作用，进行了体内和体外试验，从神经行为学、形态学、氧化应激水平、细胞凋亡等方面研究NO/NOS介导的氧化应激以及KCC2/GABAAR通路在脑缺血损伤中的作用及机制。研究结果显示，脑缺血导致大鼠呈现焦虑样行为，引发氧化应激反应，NO/NOS表达增加，皮质神经元发生凋亡或坏死，提示NO/NOS信号通路在脑缺血病理过程中起着关键作用。应用PC12细胞建立氧糖剥夺（OGD）模型，以模拟体内脑缺血条件。体外试验结果显示，缺血后NO/NOS表达升高，氧化应激损伤显著，神经元损伤和细胞凋亡明显，应用NOS阻断剂L-NAME可以缓解OGD诱导的氧化应激损伤，降低NO/NOS的表达，减少细胞凋亡，表明NO/NOS介导了脑缺血诱导的氧化应激损伤。此外，大鼠脑缺血状态下KCC2/GABAAR表达显著降低，GABA能信号系统中GABA含量及GAD67酶活性显著升高，同时细胞凋亡增加。采用GABAAR激动剂蝇蕈醇（Mus）预处理后，大鼠临床行为学及神经元损伤有明显改善，KCC2/GABAAR表达显著增加，GABA能信号分子表达趋于正常，NO/NOS含量减少以缓和氧化应激损伤，使细胞凋亡减少，揭示GABAAR可能是NO/NOS的上游调节因子，脑缺血状态下KCC2/GABAAR通路传递增强有助于减少细胞凋亡，缓解NO/NOS介导的氧化应激损伤，从而发挥神经保护作用。综上表明，NOS以及KCC2/GABAAR信号通路在脑缺血诱导的氧化应激和皮质神经元损伤中发挥重要作用，在此过程中NOS/NO介导了氧化应激损伤，而且KCC2/GABAAR对NOS/NO通路有调控作用。本项目为阐明缺血性脑损伤的病理机制、寻找临床治疗的新靶点提供了可靠的理论和实验依据。