神经元上TLR4在介导脑缺血再灌注损伤中的作用及机制研究

Cerebral ischemia leads to the death of a large number of neurons, in which TLR4-mediated inflammatory responses on microglia play a key role, but the exact mechanism is still unclear. Meanwhile, TLR4 is also widely expressed in neurons and can mediate the conduction of calcium (Ca2+) influx. NMDAR2B (NR2B) is a classical receptor for regulating the conduction of Ca2+ flow and can mediate the death of neurons. These indicate that TLR4 on neurons may be involved in the neuron death pathway through NR2B. Since the direct intervention of NR2B to reduce neuronal death has serious side effects, the targeted intervention of its upstream molecules which involved in neuronal death can reduce neuronal death and prevent side effects. In view of these evidences, our preliminary experiments found that TLR4 on neurons can affect the conduction of Ca2+ flow and NR2B phosphorylation. Therefore, we hypothesized that TLR4 on neurons mediates neuron death after cerebral ischemia/reperfusion by regulating NR2B phosphorylation. Thus, our study intend to to clarify the role of TLR4 on neurons in the death of neurons caused by cerebral ischemia/reperfusion, and investigate the exact mechanism of TLR4 - mediated neuronal death. Our study not only explains how the neuronal TLR4 signal is involved in the neuronal death pathway, but provides a new target for neuronal protection after cerebral ischemia/reperfusion.

脑缺血会导致大量神经元死亡，我们前期发现小胶质细胞上TLR4介导的炎症反应在其中发挥关键作用，但精确机制尚不清楚。同时，TLR4在神经元上也存在广泛表达，并能介导钙流传导，而NMDAR2B（NR2B）是调控钙流传导的经典受体，并介导神经元死亡，提示神经元上TLR4可能通过NR2B直接参与神经元死亡。由于直接干预NR2B来减少神经元死亡存在严重的副作用，故靶向干预其与神经元死亡相关的上游分子，即能保护神经元，又能减少副作用。鉴于此，我们预实验发现神经元上TLR4确实能够影响钙流传导与NR2B磷酸化。故我们假设神经元上TLR4通过影响NR2B磷酸化介导脑缺血再灌注后的神经元死亡。本项目拟进行：明确神经元上TLR4在缺血再灌注导致神经元死亡中的作用；探讨神经元上TLR4介导神经元死亡的精确机制。该研究不仅解释了神经元TLR4信号是怎样参与神经元死亡途径的，也可望为缺血再灌注后神经元保护提供新靶点

背景与目的:小胶质细胞中的Toll样受体4 (TLR4)在脑缺血后神经炎症反应中的作用是众所周知的。同时，TLR4在神经元中也有表达，可介导钙(Ca2+)内流的传导，但神经元TLR4信号通路与脑缺血损伤之间的机制联系尚不清楚。因此，我们试图阐明神经元上的TLR4在缺血性卒中发病机制中的作用机制。.方法:分别采用TLR4敲除小鼠(TLR4-/-)和谷氨酸神经元TLR4条件敲除小鼠(TLR4cKO)的原代神经元细胞培养建立体外和体内缺血模型。在体外缺血模型中检测细胞内Ca2+、神经元死亡和n -甲基-d-天冬氨酸受体亚基2B (NMDAR2B)活性。此外，我们评估了小鼠脑缺血/再灌注(I/R)后的梗死体积、神经功能缺损、神经元死亡和n -甲基-d-天冬氨酸受体亚基2B (NMDAR2B)活性。.结果:我们发现敲除TLR4可以减少由氧和葡萄糖剥夺(OGD)或脂多糖处理引起的神经元死亡和细胞内Ca2+升高。脑I/R损伤发生后，TLR4cKO小鼠的脑梗死体积和功能缺陷也得到缓解。此外，TLR4和NMDAR2B在神经元中共定位。在体外和体内，条件性敲除神经元中的TLR4可通过Src激酶磷酸化缺血诱导的NMDAR2B上调。脑I/R损伤发生后，TLR4cKO小鼠NMDAR2B的下游信号，神经元一氧化氮合酶(nNOS)与突触后密度蛋白-95 (PSD-95)的相互作用也被中断。.结论:我们描述了一种新的分子神经元通路，神经元上的TLR4信号在介导神经元死亡中起着至关重要的作用，为缺血性卒中后的神经保护提供了新的靶点。