宁夏地区牛源E.coli毒力基因的检测及多重耐药机理研究

应用分子生物学实验技术，研究宁夏地区牛大肠杆菌的优势血清型与毒力基因和耐药性之间的关系，以及整合子和16S rRNA甲基化酶介导的产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌多重耐药机理。采用玻片凝集法测定血清型，通过PCR方法调查毒力基因，用微量稀释法测定药物的MIC，从而分析它们之间的相关性；通过纸片确认方法筛选产酶菌株，然后PCR扩增产酶菌的ESBLs基因，测定其基因序列，确定ESBLs的基因型，从而探究其基因型与耐药表型的关系；PCR扩增产酶菌的16S rRNA甲基化酶基因，采用脉冲场凝胶电泳（PFGE）、膜结合试验和southern杂交等研究方法分别从水平传播和垂直克隆传播揭示16S rRNA甲基化酶基因的转移机制；通过全面分析，明确整合子和16S rRNA甲基化酶介导的产ESBLs大肠杆菌的多重耐药机制，对预防大肠杆菌耐药性产生及有效防治大肠杆菌感染性疾病具有重要意义。

随着养殖业的逐渐规模化，抗菌药物的过度使用，导致大肠杆菌的耐药性及其多重耐药性已严重影响了兽医临床疾病的治疗，因此对宁夏地区牛源大肠杆菌进行毒力基因检测和耐药性分析及多重耐药机制的研究，不但对大肠杆菌引起的疾病防治具有指导意义，而且有利于控制耐药菌株的产生和传播。 本研究主要采集宁夏地区部分奶牛场的乳房炎乳样及犊牛腹泻粪便样，进行大肠杆菌的分离鉴定；采用玻片凝集法测定血清型；通过PCR方法调查毒力基因；根据CLSI推荐的肉汤微量稀释法测定16种抗菌药物对大肠杆菌分离株的MIC值；采用PCR技术对菌株的Ⅰ型整合子-基因盒进行扩增；通过纸片确认方法筛选产酶菌株，然后PCR扩增产酶菌的ESBLs基因和16S rRNA甲基化酶基因，采用脉冲场凝胶电泳（PFGE）、膜结合试验和southern杂交等研究方法分别从水平传播和垂直克隆传播揭示16S rRNA甲基化酶基因的转移机制。结果显示，分离鉴定出的245株牛源大肠杆菌对氨苄西林的耐药率最高，达到51.84%，其次是链霉素（37.96%）、多西环素（36.33%）、四环素（35.51%）以及头孢唑林（30.20%）。对多粘菌素、氟苯尼考、氨基糖苷类、头孢类及喹诺酮类抗菌药物则相对比较敏感，敏感率都在60%以上。优势血清型有O127、O158和O44，有6株为自凝，53株未定型。Ⅰ型整合子检出率为14.29%；35株Ⅰ型整合子阳性菌株中32株菌扩增出7种类型的基因盒插入区片段，以介导甲氧苄啶和氨基糖苷类耐药的dfrA和aadA为主，基因盒排列dfrA17-aadA5和dfrA7较为流行，并且dfrA7为国内首次从牛源性大肠杆菌中发现。16S rRNA甲基化酶基因只检测出rmtB基因，检出率为5.3%（13/245）；ESBLs基因blaTEM、bla CTX-M、blaOXA的检出率分别为23.27%、11.02%、2.86%；检出的13株rmtB阳性大肠杆菌中还检出了blaTEM-1、blaCTX-M基因，并检出了2株blaOXA-1基因，检出率分别为100.0%(13/13)、100.0%(13/13)和15.38%(2/13) 。16S rRNA甲基化酶基因扩散机制的研究显示，宁夏地区牛源大肠杆菌中rmtB基因的扩散方式主要通过垂直和水平传播两种方式扩散。