基于HPLC-NMR技术的解毒祛瘀滋阴方治疗系统性红斑狼疮的代谢组学研究

系统性红斑狼疮（SLE）是自身免疫介导的，以免疫性炎症为突出表现的弥漫性结缔组织病，范永升教授根据长期临床经验研制的解毒祛瘀滋阴方作用确切，但其作用机制尚不清楚。基于目前某些生理、生化指标的评价方式难以体现SLE的整体性和动态性，本研究拟借助HPLC-NMR二维耦合技术，研究"MCP1基因敲除"法建立的MRL/lpr狼疮小鼠模型的代谢组学特征，探寻与SLE相关的生物标志物(群)，并基于此建立SLE小鼠模型代谢组学评价方法；同时，基于本课题组在解毒祛瘀滋阴方质量控制和药理研究方面的良好工作基础，拟从代谢组学角度研究解毒祛瘀滋阴方的作用机制，探索解毒祛瘀滋阴方给药组的代谢特征及其与SLE生物标记物(群)的相关性，并据此探索解毒祛瘀滋阴方的作用机理。本课题的开展，将在解毒祛瘀滋阴方作用机制的代谢组学研究方面做出有益探索，并为解毒祛瘀滋阴方的进一步开发应用提供科学依据。

为了阐明解毒祛瘀滋阴方治疗系统性红斑狼疮作用机制，收集醋酸泼尼松治疗组、解毒祛瘀滋阴方治疗组、SLE模型组（MRL/lpr）和昆明种C57BL/6J对照组小鼠的尿液和血清样本，采用高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用（HPLC-Q-TOF/MS）的代谢组学方法，研究系统性红斑狼疮（SLE）模型小鼠经解毒祛瘀滋阴方治疗后血清和尿液代谢物的变化，并探讨SLE发病及解毒祛瘀滋阴方作用机制。应用Mass Hunter和MPP软件处理数据，结合正交偏最小二乘法（Orthogonal partial least squares, OPLS）对实验数据进行模式识别，发现对照组、SLE模型组、解毒祛瘀滋阴方治疗组和醋酸泼尼松治疗组的代谢图谱存在较明显的差异。根据OPLS载荷图，利用精确质量数结合二级质谱鉴定出血清中Traumatic Acid、PAF、12(S)-HETE、15(S)-HETrE、Hepoxilin B3等12种差异代谢物，以及尿液样本中9种有重要影响的代谢标志物。结果表明，SLE小鼠经解毒祛瘀滋阴方治疗后，可以有效调节血清中PAF、12(S)-HETE等差异代谢物的相对含量接近于对照组水平，并且能多维修复SLE小鼠尿液中失衡的甘氨酸、苯丙氨酸和色氨酸代谢通路。代谢通路分析表明，SLE发病会导致体内不饱和脂肪酸和氨基酸代谢通路显著变化，而解毒祛瘀滋阴方对SLE紊乱的代谢通路具有一定修复代谢失衡作用。.将对照组和SLE模型组尿液样本离心冻干后，采用液相制备色谱(HPLC)制备获得若干尿液组分，进行NMR分析。结果表明：使用制备色谱可以将尿液样本分离，按组分的保留时间大小，尿液中部分代谢物得到有效分离，尿液样本分为8个组分，表明HPLC -NMR实验方法对NMR图谱具有降维简化作用。进一步统计分析发现，通过HPLC降维再解析NMR图谱，鉴定出尿液中部分代谢物，并且部分代谢物相对含量在组间存在一定差异。结合代谢通路分析，SLE模型组中甘氨酸相对含量显著降低，证实了SLE发病致使甘氨酸代谢异常；酪氨酸及其代谢物琥珀酸相对含量在SLE模型组和对照组中含量也存在明显差异，佐证了苯丙氨酸、酪氨酸代谢紊乱与SLE的相关性。此外，SLE模型组中苏氨酸和缬氨酸的相对含量与对照组相比也有显著差异。因此，部分氨基酸相关代谢通路紊乱可能与SLE发病机制有关，其深入代谢机制有待进一步阐明。