微小隐孢子虫肝素结合蛋白质的鉴定和功能研究

Cryptosporidium parvum is an apicomplexan parasite that can cause serious watery diarrhea,cryptosporidiosis, in human and other mammals. Cell surface glycosaminoglycans (GAGs) play an important role in the attachment and invasion process of a variety of intracellular pathogens. C. parvum invades gastrointestinal epithelial cells,which have abundant glycosaminoglycans on their cell surface. Sulfated glycans such as.heparin and heparan sulfate have been reported to inhibit cell invasion by C. parvum.However, little is known about the interaction between C. parvum and glycosaminoglycans. Firstly, the parasite-derived components were affinity purified on the heparin moiety followed by MS fingerprinting of the proteins.The construction of candidate proteins will be predicted by bioinformatic softwares. Then the corresponding peptides will be synthesed and the McAbs against them will be prepared. The localization of selected proteins will be identified by indirect immunofluorescence microscopy and immunoelectron microscopy with McAbs. Cell-binding ELISA and IFA will be used to evaluate the attachment of the recombinant proteins to HCT-8. Lastly, preassembled Single-Stranded RNA–Argonaute (hAgo2-ssRNA) Complexes will be used to silence the target gene. The infection rate will be compared with the control group to evaluate the effect on invasion. The study will further our understanding of the molecular basis of C. parvum invasion and are of value for the development of novel anti-cryptosporidial agents.

作为顶复门原虫中的一员，隐孢子虫可引起人和其它哺乳动物严重的水样腹泻。目前还没有有效的药物和疫苗来控制该虫感染。隐孢子虫感染的肠上皮细胞表面富含硫化肝素等硫化多糖。研究表明，肝素或硫化肝素能够显著抑制隐孢子虫对肠上皮细胞的侵入，然而这一过程涉及的分子机制尚不清楚。本研究首先通过亲和层析分离隐孢子虫子孢子的肝素结合蛋白，然后通过全谱分析鉴定分离的蛋白，然后对获得的蛋白进行结构和功能预测，选取胞外区特异性区域制备多肽，免疫小鼠制备单克隆抗体，然后通过免疫荧光和免疫电镜技术对其进行亚细胞定位，选取定位于虫体头端和表膜的蛋白质进行功能研究。采用哺乳动物细胞表达系统制备重组蛋白，通过亲和ELISA和IFA鉴定蛋白质的黏附特性。最后通过体外构建hAgo2-ssRNA沉默复合体转染子孢子，比较对虫体侵入率的影响。本研究将为阐明隐孢子虫侵入分子机制提供依据，也为研制新型抗隐孢子虫治疗药物奠定基础。

作为顶复门原虫中的一员，隐孢子虫可引起人和其它哺乳动物严重的水样腹泻。目前还没有有效的药物和疫苗来控制该虫感染。隐孢子虫感染的肠上皮细胞表面富含硫化肝素等硫化多糖。研究表明，肝素或硫化肝素能够显著抑制隐孢子虫对肠上皮细胞的侵入，然而这一过程涉及的分子机制尚不清楚。本研究以隐孢子虫特有的TRAP家族部分成员和部分I型跨膜蛋白为研究对象，首先通过制备特异性抗体，通过IFA筛选位于子孢子表膜或头端的蛋白质进行后续研究，然后进行基因的克隆、表达，制备重组蛋白，通过细胞结合ELISA、流式细胞计数、间接免疫荧光确定能够与HCT-8结合的蛋白质，确定其结合动力学参数。然后，通过亲和层析及肝素阻断实验初步确定肝素结合蛋白，再通过肝素包被的ELISA对其结合能力进行定量，并确定其结合动力学参数。然后，通过多肽抑制实验、分子模拟和氨基酸突变实验确定肝素结合蛋白TRAP4的肝素结合基序。最后，通过体外感染实验确定TRAP4蛋白及其基序在虫体黏附和入侵过程中的作用。本研究共获得了7个肝素结合蛋白，其中4个为TRAP家族蛋白（TRAP4、TRAP3、TRAP7和TRAP-C1），3个为微小隐孢子虫I型跨膜蛋白（IPTH、Cgd7_2530和Cgd7_4470）。细胞结合实验结果显示，重组蛋白质IPTH与HCT-8细胞以纳摩尔水平结合（Kd = 16.2 nM），重组蛋白质TRAP4、TRAP3、TRAP7与HCT-8细胞以微摩尔水平结合（结合常数Kd 分别为0.16 μM、0.29 μM和0.17 μM）。肝素结合实验结果显示，TRAP4、TRAP3、TRAP7和TRAP-C1与肝素的结合常数分别为0.09 μM、0.29 μM、0.1 μM和0.64 μM。多肽抑制实验和氨基酸突变实验结果显示，112IKCKKW117是TRAP4蛋白与肝素结合的基序，其中115 K和116 K是关键氨基酸。本研究结果揭示了TRAP家族蛋白和I型跨膜蛋白的细胞结合和肝素结合活性和TRAP4的肝素结合基序，为开发基于肝素结合的隐孢子虫药物和疫苗提供了理论依据。