喜马拉雅旱獭线粒体全基因组序列及与低氧适应相关性的研究

The Himalayan woodchucks is ahypoxia adaptation ability of small mammals, which live in the elevation of 3000-5200m in alpine region. The previous research showed that the species may be associated with hypoxia adaptation ability of the special structure of the mitochondrial genome. he studies will obtain Himalaya marmot mitochondrial sequence through mitochondrial DNA library construction, and shotgun sequencing, Then analysis its genetic composition, protein coding sequence, tRNA or rRNA structure . On this basis ,we will sequenced 10 cases of the Himalayan woodchucks mitochondria sequence living in different altitude regions by design Long-PCR primer , use Primer-walking method, and analysis the polymorphism sites. We will expand the number of experimental animals (at least 50 cases) to PCR amplificate and sequence on the polymorphic site area , and analysis the relevance between these site and haplotypes with hypoxia adaptation ability The results not only can better explain the origin of Himalaya marmots, system evolution and regional migration and other issues, but also for the plateau native animal hypoxia adaptation mechanism to lay the foundation, has the important theory and the practical significance.

喜马拉雅旱獭是一种低氧适应能力很强的小型哺乳动物，多生活在海拔3000-5200m的高寒地区。前期的研究结果表明该物种的低氧适应能力可能与其线粒体基因组结构的特殊性有关。本研究拟通过构建线粒体DNA文库、鸟枪法测序，获得喜马拉雅旱獭的线粒体全序列，并对其基因组成、蛋白质的编码序列、tRNA或rRNA结构等作详尽分析，在此基础上，设计Long-PCR引物，采用Primer-walking方法，对生活在不同海拔地区的10例喜马拉雅旱獭的线粒体全序列进行测序，分析可能的多态性位点，进而扩大实验动物的数量（至少50例），对可能的多态性位点区进行PCR扩增和测序，并分析这些位点或单倍型与低氧适应能力的相关性。研究结果不仅可较好的解释喜马拉雅旱獭的起源、系统演化及地缘性迁移等问题，也可为高原土著动物低氧适应机制的研究奠定基础，具有重要的理论和实践意义。

本研究利用LA-PCR（long amplification polymerase chain reaction）和普通PCR的方法获得了喜马拉雅旱獭线粒体基因组全序列。并结合生物信息学分析方法，分别构建了30个啮齿目物种的系统进化树和15个松鼠科物种的进化树，所获得的研究结论如下：.(1) 喜马拉雅旱獭线粒体基因组全序列长16,443 bp，其中包含2个rRNA基因，22个tRNA基因，13个蛋白质编码基因（PCGs）和一段长度为997 bp的控制区序列。其中H链共编码28个基因，包括2个rRNA基因，12个蛋白质编码基因和14个tRNA基因，其余基因由L链编码，所有基因的排列顺序与大部分哺乳动物相同。.(2) 在核苷酸组成上，2个rRNA基因和13个蛋白质编码基因A+T含量从COX 3的59.4%到ATP 8的67.7%以及控制区的62.2%与全序列的63.5%相一致，均有明显的AT偏向性。.(3) 喜马拉雅旱獭线粒体除控制区外，共有16处总长度为78 bp的基因间隔和3处总长度23 bp的基因重叠。基因微小间隔和重叠区的存在说明线粒体基因排列的紧凑性。.(4) 在蛋白基因的起始密码子使用方面，除ND2和ND5使用ATT以及ND3使用ATA外，其余均以ATG为起始密码子。在所使用的终止密码子中，COX 1和ATPase 8为TAG，COX2、ND4L和ND5为TAA，ND6和CYTB为ATG，其余的6个蛋白基因均使用不完整的终止密码子。.(5) 在预测的22个tRNA基因的二级结构中，除tRNA-Ser(GCU)缺少D臂之外，其余的均可形成典型的三叶草结构。所有预测的二级结构中共出现9处错配，分别有3处U-U，2处A-A，3处A-C和1处A-G。.(6) 通过与啮齿目其他动物线粒体控制区序列的比较分析，将喜马拉雅旱獭线粒体控制区分为终止序列区、中央保守区和保守序列区3个区域，并识别了其中的7个保守序列：CSB-F、CSB-D、CSB-C、CSB-B和CSB-1。.(7) 对30种啮齿总目动物的线粒体基因组全序列（控制区除外）进行比较分析，采用ML法和贝叶斯法构建啮齿目动物系统进化树。结果证明喜马拉雅旱獭与欧洲红松鼠关系最近。.(8) 对15种松鼠科动物的线粒体控制区序列进行比较分析，采用NJ法和ML法，构建松鼠科动物系统进化树，结果表明，在松鼠科内部喜马拉雅旱獭