Dmrt1在中华鳖雄性性别决定中的作用研究

鉴于龟鳖类温度依赖性性别决定（TSD）分子机理的尚不清楚以及性别调控在中华鳖养殖中的巨大应用价值，因此开展中华鳖性别决定的分子机理研究具有重要的科学意义和社会经济价值。本项目拟以中华鳖性别决定相关基因Dmrt1为切入点，以Dmrt1基因cDNA全序列的克隆及Dmrt1抗体的制备为基础，针对基因敲除技术难以在中华鳖等非模式动物上实现的缺陷，利用显微操作技术将Lentivirus RNAi系统引入中华鳖胚胎，建立新的基因功能研究模型，以此研究中华鳖Dmrt1在性腺中的细胞定位，在不同孵化温度下的表达差异性及Dmrt1基因沉默后雄性性腺分化方向和Sox9等基因表达的变化。旨在阐明Dmrt1在中华鳖雄性性别决定和性腺分化中的具体功能作用，揭示Dmrt1与孵化温度及Sox9等其他性别决定基因的互作关系，不仅在一定程度上解析TSD的分子机制，并且为人工性别调控在中华鳖养殖中的应用提供理论依据。

中华鳖为中国主要的名贵水产养殖品种，在养殖过程中，雄鳖比雌鳖生长快，个体大，裙边宽厚，脂肪少。近年来，业内围绕着中华鳖性别控制技术已作了较长时间的探索，但尚无法使雄性鳖苗比例超过65%，其主要原因在于中华鳖性别决定分子机制尚不清楚。本项目以性别分化相关基因Dmrt1为切入点，研究其在中华鳖雄性性别决定中的作用及机理。第一，RACE结果显示，Dmrt1基因cDNA序列全长2409 bp，其中5’非编码区为230 bp，3’非编码区为1072 bp，开放阅读框为1107 bp，编码368个氨基酸，具有一个高度保守的DM结构域。第二，从mRNA和蛋白水平研究Dmrt1基因的组织差异性表达、在不同发育阶段性腺中的细胞定位及在性逆转中的表达变化，qPCR和免疫组化结果显示，Dmrt1在性腺分化之前的第16期雄性性腺中开始表达，先于Amh和Sox9基因，Dmrt1蛋白主要定位于性腺Sertoli细胞细胞核上，在雌性性腺发育过程中并未见其表达。此外，在雌二醇诱导的雄性转雌性性逆转胚胎性腺中，Dmrt1表达显著下调；在芳香化酶抑制剂诱导的雌性转雄性性腺中，Dmrt1表达则显著上升。第三，成功构建了慢病毒Dmrt1-shRNA和慢病毒Dmrt1表达载体系统及鳖胚显微操作技术，成功使Dmrt1基因在胚胎发育中异常表达，建立了重要基因的功能研究平台。第四，利用以上技术平台，发现Dmrt1基因敲低后, ZZ胚胎出现雄向雌的性逆转现象，雄性特异性基因Sox9的mRNA和蛋白表达显著下调，雌性基因Cyp19a1和Foxl2的mRNA表达则显著上调；而Dmrt1基因过表达后的ZW胚胎则出现雌向雄的性逆转现象，Sox9表达剧增，Cyp19a1和Foxl2表达骤降。第五，研究了雌激素在中华鳖性别分化中作用，发现雌激素通过抑制Dmrt1和Sox9的表达抑制雄性分化，促进雌性分化和卵巢发育。基于此，本项目还建立了以芳香化酶抑制剂为诱导剂的胚胎期雄性诱导技术，子代雄性率90%以上，已在绍兴、余姚多家甲鱼养殖企业进行了20万枚鳖卵规模的技术示范，效果良好。.总之，本项目表明中华鳖Dmrt1基因为雄性特异性基因，在雄性性腺分化中是必需的，能单独启动雄性分化，是早期雄性性别决定的关键因子，这为中华鳖性别决定分子机理的进一步研究奠定了基础。同时中华鳖胚胎期雄性诱导技术的建立一定程度上推进了中华鳖单性育种的发展。