表观遗传修饰在中华鳖性别决定中的调控机制

As one of the world’s economically most important aquatic animals, the Chinese softshell turtle (Pelodiscus sinensis) has differential sexual chromosomes, and temperature-dependent sex determination (TSD), but the biological basis of its TSD is still poorly understood. By incubating the turtle eggs at different temperatures, sampling gonad tissues at the temperature sensitive period (TSP), determining the DNA methylation patterns of the sexual control genes by bisulfate sequencing PCR (BSP), and identifying differentially expressed miRNAs at different temperatures by next generation sequencing (NGS), this study aims to analyze the response of the DNA methylation and miRNAs to temperature changes and its relationship with sex determination. Sampling the gonad tissues again after the eggs was treated with methylation inhibitors and miRNA mimics at TSP, and then analyze the interactions between the DNA methylation and miRNAs, and their effects on the expression of sex control genes and steroid hormones, to reveal the regulation of the epigenetic modifications on sex determination of the Chinese softshell turtle. Generally, this study has important theoretical values for understanding reptile’s TSD, and has potential implications for the production of soft-shelled turtle and the protection of endangered chelonians.

中华鳖是世界上最重要的水产经济动物之一，其拥有分化的性染色体，但同时性别决定又受到孵化温度的显著影响，目前关于该物种温度依赖性别决定（TSD）的分子调控机制尚不清楚。本研究拟在不同温度下孵化中华鳖卵，在性腺分化的温度敏感期采集性腺样品，利用亚硫酸盐测序法分析关键性别控制基因启动子区的甲基化修饰模式，利用下代测序技术鉴定不同孵化温度下差异表达的miRNAs，分析DNA甲基化修饰和miRNAs对温度变化的响应及其与性别决定的关系；使用甲基化酶抑制剂和miRNA mimics处理孵化卵后重新采集性腺样品，分析DNA甲基化和miRNAs在中华鳖TSD中的互作，及其对性别控制基因和性激素表达水平的影响，进而揭示表观遗传修饰在中华鳖性别决定中的调控机制。本研究的开展不仅对于理解爬行动物TSD具有重要理论价值，而且对于中华鳖的生产实践、濒危龟鳖类的保护都具有重要的意义。

爬行动物的温度依赖型性别决定（TSD）是一个复杂且有趣的生物学问题，TSD动物的性别决定于其孵化时的环境温度而不是遗传物质，但目前对于TSD的遗传调控机制并不清楚。表观遗传修饰在很大程度上介导了机体对环境变化的响应，同时也整合了环境与基因组信息来产生特定的表型，因此推测表观遗传修饰，包括DNA甲基化和miRNA，可能是动物TSD的重要调控机制。（1）验证了孵化温度对中华鳖和乌龟性别决定的影响，结果表明，中华鳖不属于TSD动物，而乌龟属于典型的TSDIa型动物。（2）克隆了乌龟cyp19a1基因的启动子，并分析了孵化温度对乌龟cyp19a1基因启动子区甲基化水平的影响，结果表明高孵化温度能够引起乌龟cyp19a1基因启动子区的甲基化水平降低，其引起的cyp19a1基因表达水平上升，能够进一步引起雌激素水平上升，最终导致雌性个体的增多。（3）通过分析不同孵化温度下AKG样品中的miRNA和转录组表达水平，发现有18个miRNA的表达水平能够响应孵化温度的变化，并能够调控多个与性激素相关的基因，提示miRNA参与了TSD动物的性别决定过程。其中miR122的表达水平在高温组显著降低，其靶基因CYP3A的表达水平则显著上调，由于CYP3A的生物学功能是使睾酮失活，因此miR122表达水平的下调最终可能导致雄性后代的减少。综合来讲，本项目的研究结论表明表观遗传修饰包括甲基化和miRNA也是动物TSD的重要调控方式，对于未来动物的TSD研究提供了全新的视角。