中华鳖刺鼠信号蛋白（ASP）在乌质性状调控中的作用研究

Qingxi Wubie is a rare local variety of Pelodiscus sinensis, and its main characteristics is the whole black body with high economic value. The cardinal melanin trait is an important economic character of selective breeding for Pelodiscus sinensis. In order to clarify the molecular mechanism of melanin properties formation for Wubie population, we screen the differential expression genes of skins at the transcriptome level and search for the key genes of regulation and control in melanin synthesis. The Japan population with white plastron is used as control sample. We select agouti signaling protein, the key reverse regulation factor in the melanin synthesis, as the research object, and study the gene structure, expression level, regulatory factor, interacting protein and the key regulatory pathway. In order to further illuminate the function mechanism of ASP, we handle the Japan population and the Wubie embryos using lentiviral transfection to silence or over-express ASP, respectively, then measure the skin melanin deposition changes and the expression quantity changes of the related genes in cAMP-TYR regulatory pathway. As a result of this research, we can summarize the melanin deposition mechanism in the Wubie body based on the direction of TYR gene families transcriptional regulation mediated by ASP. This work has great scientific importance in stabling the cardinal melanin inheritable character of Wubie population and promoting quality improvement of Pelodiscus sinensis.

清溪乌鳖是我国近年来选育的一种珍贵的中华鳖（Pelodiscus sinensis）地方品种，其最大特征是全身乌黑，经济价值高。乌质性状是中华鳖良种选育的一个重要经济性状。为了阐明清溪乌鳖乌质性状形成的分子机理，我们以白色腹甲的中华鳖日本品系为对照，在转录组水平筛选皮肤差异表达基因，拟找出黑色素合成的关键调控基因。明确以黑色素合成反向调控的关键因子刺鼠信号蛋白（ASP）为研究对象，从ASP的基因序列、表达水平、调控因子、互作蛋白和作用路径等方面展开研究。进一步以慢病毒转染的方式对日本品系和清溪乌鳖胚胎分别进行ASP基因沉默和过表达处理，测定皮肤黑色素沉积及cAMP-TYR通路相关基因表达量变化，阐明ASP基因在中华鳖乌质性状形成中的作用机理。最终从ASP对TYR基因家族转录调控的角度，归纳出清溪乌鳖体内黑色素沉积的机理。本项目对稳定乌鳖的乌质性状遗传，促进中华鳖品质改良具有重要的科学意义。

清溪乌鳖是我国近年来选育的一种珍贵的中华鳖（Pelodiscus sinensis）地方品种，其最大特征是全身乌黑，经济价值高。乌质性状是中华鳖良种选育的一个重要经济性状。为了阐明清溪乌鳖乌质性状形成的分子机理，我们以白色腹甲的中华鳖日本品系为对照，在转录组水平筛选皮肤差异表达基因，发现黑色素合成的关键调控基因包括反向调控因子刺鼠信号蛋白ASP和黑色素合成的两个重要酶TYRP1、DCT。接着以黑色素合成反向调控的关键因子ASP为研究对象，从基因序列、表达水平、互作蛋白和作用路径等方面展开研究。完成了两品系ASP、MC4R等基因序列测定，发现日本品系中存在两种ASP mRNA表达结构，而清溪乌鳖只获得一种mRNA表达结构。计算机模拟分析了ASP及MC4R受体蛋白高级结构和生物学活性。完成了ASP的体外表达、TYR序列和启动子序列分析等内容。利用酵母双杂交和免疫共沉淀技术进行ASP相互作用因子与核心作用蛋白筛选，完成ASP和MC4R受体的互作分析，完成ASP相互作用蛋白的PPI分析，获得ASP相互作用的核心蛋白APOA1、APOB等。完成清溪乌鳖和日本品系胚胎发育期黑色素沉积规律和诱导关键期分析。进一步以慢病毒转染的方式对日本品系和清溪乌鳖胚胎分别进行ASP基因沉默和过表达处理，筛选到两种ASP RNA干扰的shRNA序列以及TYR的全长序列过表达处理，对日本品系背部和腹部均有明显的促进黑色素合成和沉积、加深体色的诱导作用；筛选到一种TYR RNA干扰的shRNA序列以及ASP的全长序列过表达处理，对清溪乌鳖品系背部和腹部均有明显的抑制黑色素合成和沉积、体色变浅的影响作用，由此揭示了ASP、TYR基因在中华鳖乌质性状形成中的作用及其机理。本项目对稳定乌鳖的乌质性状遗传，促进中华鳖品质改良具有重要的科学意义。