温度诱导中华鳖性别分化的关键基因鉴定及决定机制研究

There are two sex determination mechanism in reptiles,chromosome-dependent sex determination and environment-dependent sex determination,environment temperature is a typical influence factor.With the depth research on animals sex differentiation relative genes, temperature-dependent sex determination is more complicated,it is the research difficulties in sex determination mechanism as well as the focus in recent study.Usually ,the growth speed of males faster than females during the breeding process ,the skirts of males is more generous ,and have a higher economic value. Sex differentiation of T.sinensis is related with incubation temperature, a large proportion of females in higher hatching temperature, while in lower hatching temperature the ratio of males is large, at the incubation temperature of (29±0.5)℃,the ratio of females and males is approaching.This project use different hatching temperature to induce T.sinensis sex differentiation ,select the T.sinensis embryos before and after sex differentiation for material,use transcriptome sequencing,sexual chromosomal type and sex hormones detection technology to analysis gonadal differentiation,filter and clone the key genes which influence sex differentiation,gain the sequence of key genes through RACE technology,and use real-time quantitative PCR to further validate the role of key genes in gonadal differentiation and gonadal development of T.sinensis,discussion differentiation of T.sinensis sex determination mechanism induced by temperature in molecular level, provide scientific theory for T.sinensis sex differentiation regulation, to achieve all-male cultivation and facilitate healthy development of T.sinensis.

爬行动物的性别决定有染色体决定和环境决定两种机制，环境温度是较为典型的影响因子，对动物性别分化相关基因的深入研究发现，温度依赖型性别决定机制更为复杂，是性别决定机制中的研究难点，也是现阶段研究的重点。在中华鳖养殖过程中，通常雄性的生长速度快于雌性，且裙边较宽厚，具有更高的经济价值。中华鳖的性别分化与孵化温度有关，温度高雌性比例大，温度低雄性比例大，在29±0.5℃时雌雄比例相近。本项目通过不同温度诱导中华鳖的性别分化，选取中华鳖两性分化前至分化后的胚胎为材料，利用转录组测序、性染色体型检测和性激素检测技术分析性腺分化情况，筛选、克隆影响性别分化的关键基因，利用RACE技术获得关键基因序列，并采用实时荧光定量技术进一步验证关键基因对中华鳖性腺分化和性腺发育的作用，从分子水平探讨温度诱导中华鳖性别分化的决定机制，为调控中华鳖性别分化、实现全雄养殖、促进中华鳖产业健康发展提供科学理论依据。

本项目通过不同温度诱导中华鳖的性别分化，选取中华鳖两性分化前至分化后的胚胎材料，利用转录组测序筛选、克隆影响性别分化的关键基因，验证关键基因对中华鳖性腺分化和性腺发育的作用机制，研究成果为调控中华鳖性别分化、开展标记辅助育种、实现中华鳖全雄生产提供了科学理论依据。结果如下：.（1）发掘了中华鳖性别决定和调控的关键基因：通过RNA-seq对中华鳖性别分化期、决定期、出壳期三个阶段的雌雄转录组进行了比较研究，发现在三个时期分别有差异基因975、43和300个，PSMD9,HVCN1和GLT1D1基因在三个阶段均表现显著差异，荧光定量验证表明foxl2在胚胎期雌性表达显著高于雄性，foxl2, tgfβ-3, sox7, mex3b, wnt4, wnt7a, fgf9可能与雌性卵巢发生或形成有关，psmd9, srsf9, ubc, chfr, ampk, aldh2可能与雄性性腺的形成有关。推测CYP1A1，RASD1，CCRN4L在雌性分化中扮演重要角色，以及TBX1，AMH，DMRT1，CYP26A在雄性分化的起到的重要作用。.（2）克隆了中华鳖性别发育相关基因：克隆了Sox17、 Cyp26A1基因cDNA全长，并进行了qPCR验证其在1、2、3龄中华鳖不同组织及不同胚胎发育期性腺中的差异表达情况。同时开展RNA-Seq和ATAC-Seq联合分析研究，表明中华鳖雄性性别决定期Promoter显著增强区域的关联基因为989个，位于Promoter的染色质开放性显著减弱区域的关联基因为1,059 个。.（3）开展了中华鳖性别与生长性状相关SNP筛选工作，采用ARMS-PCR的方法在23个中华鳖生长相关的基因上共成功分型了73个SNPs位点，获得了中华鳖生长特异分子标记（A-1609G和A-1586G）和关键候选基因（GHITM 和IGFBP1），并基于基因组重测序批量开发了中华鳖性别、生长相关SNP标记。.（4）开展中华鳖抗性分子筛选研究，共筛选得到36个差异表达的免疫相关基因，同时获得中华鳖MHCⅡα基因的cDNA全长序列，并研究其在病原感染中的作用。