低剂量镉暴露对破骨细胞分化的影响及机制

低剂量镉暴露可以导致骨密度下降及骨质疏松的发生，但其机制不甚清楚。镉暴露人群骨吸收过度活跃及申请人前期研究证实低剂量镉能够刺激破骨细胞形成及活性，提示破骨细胞是低水平镉骨损害靶细胞。本项目将在动物实验及细胞实验进一步研究低剂量镉暴露对破骨细胞分化影响；以成骨细胞-破骨细胞偶联因子（OPG/RANKL、TNF-alpha/IL-1alpha及M-CSF）为主要指标，观察成骨细胞在镉刺激破骨细胞分化中的作用，揭示镉促进破骨细胞分化的间接途径；在原代培养破骨细胞及RAW264.7细胞低剂量镉暴露模型上，观察破骨细胞分化相关因子（RANK、TRAF6、Fra、c-fos及c-src）基因和蛋白表达的变化，揭示镉刺激破骨细胞分化的直接途径。该研究有助于完善镉骨毒作用相关机理以及揭示低剂量镉致骨损害的细胞分子机制，并为镉致骨损害的防治提供理论依据。

骨骼是镉的主要效应器官之一。研究表明低剂量镉暴露可导致骨密度下降、骨质疏松发生率及骨折的风险增加，但其确切机理不甚清楚。研究表明镉可能具有直接的骨效应，并且破骨细胞（Osteoclast，OC）可能是低水平镉骨损害靶细胞。本课题将从体内、体外两个方面探讨低剂量镉暴露对OC分化的影响及可能机理。通过饮水染毒建立大鼠镉暴露模型，分析血清TRACP5b水平的变化；定量分析骨组织中TRAP+细胞的数量及面积，观察镉暴露剂量与OC分化之间的剂量-效应关系；测定血清中OPG/RANKL以及分析骨组织成骨/破骨偶联因子（OPG/RANKL、TNFa）蛋白表达。连续酶消化法获得成骨细胞（Osteoblast, OB）细胞，低剂量镉染毒后观察OPG/RANKL表达水平的变化。通过机械分离及RAW264.7细胞株诱导获得OC，观察镉对体外培养OC分泌TRACP5b影响以及对OC数量和活性的影响和RAW264.7细胞中RANK、TRAF6、Fra1、c-fos、c-src等分化相关因子基因表达变化。将OB细胞与RAW264.7细胞共培养，给予不同浓度的镉（0-60nmol/L）染毒，通过TRAP染色计数破骨细胞数量，并测定培养液中TRACP5 b活性及OB细胞OPG、RANKL表达变化。低剂量镉暴露可导致骨密度下降，骨代谢失衡，骨微结构损伤，骨生物力学性能下降。染毒大鼠血清OPG水平显著低于对照组，而TRACP5b 和RANKL水平显著高于对照组；低剂量镉暴露后大鼠胫骨骨组织破骨细胞数量及面积显著增加，呈良好的剂量-效应关系；骨组织免疫组化显示随着染毒剂量的增加，胫骨OPG阳性细胞逐渐减少，而RANKL阳性细胞显著增加。体外研究表明，低剂量镉作用后能够刺激破骨细胞的形成；RANKL存在时，低剂量镉作用后能够促进RAW264.7细胞向破骨细胞分化； 镉作用后破骨细胞分化相关因子（RANK、Traf6、 Fra1、c-fos、c-src）表达显著增加； 成骨细胞存在时，镉能显著增加破骨细胞数量及TRACP5b分泌，而加入OPG阻断RANKL后，镉暴露对破骨细胞形成没有明显影响。体内体外研究均显示低剂量镉能够刺激破骨细胞形成和分化；OPG/RANKL/RANK以及下游信号分子可能参与镉刺激破骨细胞形成的过程。该研究有助于完善镉骨毒作用相关机理以及揭示低剂量镉致骨损害的细胞分子机制。