外排泵Rv1258c及其突变影响结核分枝杆菌耐药性的分子机制

Bacterial efflux pumps play an important role in drug resistance. As a typical Mycobacterium tuberculosis (Mtb) efflux pump, Rv1258c has been found involving lots of biological function and existing many amino acid mutations by many research groups including us. But how the Rv1258c and its mutants play their roles are not clear. Therefore, the molecular mechanism of efflux pump Rv1258c needs to be clarified. In this study we take the Rv1258c and its mutants as the research objects to find their clinical significance. The methods will include the Rv1258c-gene knockout and recovering with different Rv1258c mutants in clinic to find if the efflux activity and the efflux specificity to different anti-tuberculosis drugs are affected by the mutations in Rv1258c. To further investigate how the mutations in Rv1258c affect the drug resistance, the interacting proteins with Rv1258c will be found by protein interaction pulled-down method or Mtb proteome microarray method. And the protein affinity between Rv1258c or Rv1258c mutants with their interacting protein will be analyzed qualitatively and quantitatively by ForteBio Octet®RED96 bio-molecular analysis workstation, including the affinity constant (Ka) and dissociation constant (Kd) and equilibrium dissociation constant (KD). This study on Rv1258c will find the molecular mechanism of how the typical efflux pump works on ploydrug resistance in Mtb and thus benefit the deveolopment of the efflux pump inhibitors.

细菌细胞膜上的外排泵在耐药性产生方面占据重要地位。Rv1258c是结核分枝杆菌外排泵的典型代表，包括我们课题组在内的研究表明其参与多种生物学功能，且在耐药菌株中存在多种突变形式。但是目前缺乏Rv1258c发挥作用的机理研究，其突变存在的临床意义也未知。因此，本研究从临床菌株中发现的Rv1258c突变入手，以药物外泵活性的改变为突破口，通过建立Rv1258c突变体库，比较Rv1258c及其突变体的外排泵活性变化，阐明不同Rv1258c突变体与药物耐药性之间的关系以及突变是否具有药物针对性；进一步通过蛋白垂钓等体外实验方法，发现与Rv1258c形成膜蛋白复合体的互作蛋白，再经ForteBio Octet生物大分子互作工作站测定Rv1258c及其突变体与互作蛋白间的亲和力，深入阐述Rv1258c外排泵活性的分子基础以及造成多药耐药的分子机制，从而为泵抑制剂的研发和耐药结核病的防治提供理论依据。

Rv1258c是结核分枝杆菌（MTB）外排泵的典型代表，包括我们课题组在内的研究表明其参与多种生物学功能，且在耐药菌株中存在多种突变形式。本课题重点解决Rv1258c的典型突变对于MTB耐受抗结核药物的影响以及Rv1258c起作用的可能机制。本研究利用定量PCR方法发现Rv1258c在广泛耐药MTB中表达水平提高；进一步利用目的基因测序的方法，从MTB临床分离菌株中发现了G195C、T297P和 I328T突变形式，经与野生株（WT）蛋白的结构分析和药敏检测发现T297P和 I328T突变增强了对乙胺丁醇和卷曲霉素的耐受性，阐明了不同Rv1258c突变体与药物耐受性之间的特异性关系。在经过多次的蛋白表达未能拿到纯净的Rv1258c蛋白的尝试后，为了深入研究Rv1258c其作用的分子机制，我们构建了Rv1258c敲除株，以便与野生株进行蛋白组学比较，期望发现其起作用的分子机制。研究结果发现Rv1258c被敲除后组成核糖体的多个蛋白表达降低，影响到组装和蛋白合成，这可能是其生长受到影响的关键原因。另一受影响的信号途径是铁吸收相关ESX-3的表达。为验证Rv1258c与ESX-3的关系，在国际上首次采用酵母双杂交互作系统证明了ESX-3蛋白复合体中的EccB3、EccD3及其底物蛋白PPE4都能够与Rv1258c发生直接的相互作用，但是Rv1258c与EccD3和PPE4之间的互作较强，但与EccB3之间的互作较弱。于是我们提出了Rv1258c发挥外排泵作用的可能模型，进一步形成了Rv1258c-ESX3-铁代谢-氧化应激的新的研究思路和Rv1258c起作用的信号途径。此外本项目还针对外排泵蛋白DprE1改进了抑制剂，提高了杀菌效率和成药性。上述研究结果为泵抑制剂的研发和耐药结核病的防治提供理论依据。至此，本研究圆满完成了项目规定的研究任务，取得了多个创新发现。相关研究发表SCI论文5篇，其中一篇发表在结核病专业期刊Tuberculosis上，另有一篇投稿在Clinical Microbiology and Infection杂志上（稿号：CLM-23-24999）。所提出的新的科学假设进一步得到国家自然科学基金面上项目的支持（82272347）。