猪链球菌2型毒力基因岛（群）功能及其调控网络的研究

本项目拟利用生物信息学和比较基因组学分析技术，绘制不同猪链球菌2型分离株的系统进化树和基因进化树，发掘可能的新毒力相关基因和致病岛，分析基因岛（群）的结构、功能及其连锁变异与毒力衍化的关系；建立猪链球菌毒力蛋白数据库，利用酵母双杂交筛选技术和细菌转录组分析技术，研究基因岛（群）主要毒力基因协同关系及毒力蛋白互作网络；敲除主要毒力蛋白基因及毒力调控基因，测定转录谱的改变，进而利用动物模型和细胞模型验证毒力变化规律。最终明确猪链球菌2型细菌毒力效应的主要调控途径及关键环节，揭示致病作用及其毒力变异的主要分子基础，为阐明其毒力衍化变异及致病机制提供科学依据，从而解决猪链球菌2型毒力形成及其变异机制这一科学问题。

猪链球菌是在世界范围流行的人兽共患病原菌，给养猪产业和人类健康造成巨大威胁。根据荚膜多糖抗原分为不同血清型，其中血清2型（SS2）流行范围最广。根据多位点测序分型（MLST）则可分为不同的基因型以及聚类的基因群（complex）。本研究以2005年在中国四川爆发流行的SS2菌株为主要研究目标，通过基因岛预测软件、体外转录组学数据和比较基因组学等方法，鉴定可移动的遗传元件，并分析这些移动元件在SS2不同菌株中的分布及其与毒力衍化的关系。最终，在四川流行菌株基因组中共鉴定8个可移动基因岛，并且这些基因岛主要存在于SS2强毒菌株中，而在弱毒和无毒菌株中缺失，可能与致病性直接相关。本研究新建立的利用转录组数据筛选低表达的基因区域，用来预测基因岛，经证明可作为现有预测软件的有效补充，为细菌遗传进化研究提供新的思路。流行病学研究证明，中国的SS2分离菌株主要分为两大基因群，其中ST1 complex主要分离自病死猪，致病力强，多数携带8个可移动基因岛，而ST27 complex主要分离自表观健康猪，8个基因岛几乎完全缺失。两个不同基因群的菌株可能是因为携带限制-修饰系统元件完全不同，导致不同的遗传进化分歧，如携带的可移动基因岛完全不同，进而导致适应性和致病性等的差异。进而，利用温敏自杀载体和同源重组原理，敲除失活SS2强毒菌株中基因岛携带的假定毒力基因。敲除失活的基因包括，GEI5基因岛内的引物酶基因和转录调节基因，GEI5基因岛内的菌毛蛋白特异性的分选酶基因，限制-修饰系统特异性蛋白（HsdS）和代谢产物调节蛋白基因（ccpA）等。经动物试验和细胞试验证明，上述假定毒力基因的失活均导致细菌致病性不同程度的降低。经转录组（RNA-Seq）和蛋白代谢组学的比较分析证明，分析的毒力基因通过不同的途径参与细菌全局的网络调控，基因敲除失活的菌株参与能量代谢、磷酸化、甲基化和转录调节等的基因有不同程度的上调和下调，从而改变细菌的致病性和适应性。本研究系统分析SS2流行菌株携带的可移动基因岛，并且分析了基因岛携带毒力相关的基因参与致病性以及细菌全局网络调控的作用，为猪链球菌病的流行病学和防控研究提供了新的思路和方向。