类胰蛋白酶AlSP4介导绿盲蝽取食适应Bt棉的分子消化机理

Apolygus lucorum, which adapt to feeding on Bt cottons as soon as Bt cottons are large-scale applicated in China, become the primary pest on Bt cottons in the fields. The adaptability of A. lucorum to Bt cottons has been studied via ecology methods, but physiological mechanism of the adaption to Bt cottons by A. lucorum is limited. On the basis of our previous studies that AlSP4 is an important trypsin-like protease gene for A. lucorum adapting to Bt cottons, this project is aimed to measure the spatial and temporal expression of AlSP4, biochemical characteristics of AlSP4, physiological functions of AlSP4, and to clarify the effect of AlSP4 protein after A. lucorum feeding on Bt cotton by a series of molecular experiments, such as in situ hybridization, immunohistochemical, prokaryotic expression, enzyme activity analysis and RNA interference techniques. These results will confirm the hypothesis that trypsin-like protaese AlSP4 could play an important role in the adaptability of A. lucorum survived on Bt cottons in the fields by regulating the absorption of nutrition from the host materials. And then, the measurement of the total protein content, adult longevity and fecundity index in A. lucorum could be verified after A. lucorum feeding on Bt cottons. These results are also very important supplements of feeding damage mechanism on Bt cottons by A. lucorum from ecology viewpoint. This research not only help us to realize the adaptation mechanism of feeding on Bt cottons of A. lucorum mediated by digestive enzyme, but also provide scientific basis to explore the new targets of management of A. lucorum on Bt cotton fields.

Bt棉在我国大规模应用后，绿盲蝽种群数量迅速上升，演化为Bt棉田主要害虫。虽然目前已经从生态学角度研究了绿盲蝽对Bt棉的适应性，但国内外很少有关于绿盲蝽取食Bt棉后分子消化机制方面的报道。本申请拟在前期明确了类胰蛋白酶AlSP4是绿盲蝽取食Bt棉后重要消化酶的研究基础上，通过原位杂交、免疫组化、原核表达、酶活测定以及RNAi干扰等技术，重点研究AlSP4基因的时空表达、生理功能及AlSP4蛋白的生化特征，进而阐明AlSP4蛋白在绿盲蝽适应取食Bt棉过程中的作用。以上结果可以阐释AlSP4通过影响寄主营养物质的吸收，进而影响绿盲蝽总蛋白含量、成虫寿命及生殖产卵等机制，最终影响其在Bt棉田的适应性的假设。研究结果是对生态学角度研究盲蝽蟓适应Bt棉田取食危害机理在分子角度的一个重要补充，不仅可以明确消化酶介导绿盲蝽取食Bt棉后的分子消化机制，还可为Bt棉田绿盲蝽防控探索新的靶标提供科学依据。

绿盲蝽Apolygus lucorum目前是我国Bt棉上的主要害虫。前期研究表明，绿盲蝽取食Bt棉后，相比取食常规棉及四季豆对照，其体内丝氨酸蛋白酶AlSP4基因表达量显著上升(p<0.05)。.本研究利用qPCR及Western-blot技术进一步揭示了，相比取食杂交/非杂交亲本常规棉及四季豆对照，绿盲蝽取食杂交/非杂交Bt棉后，其体内AlSP4基因、蛋白的表达量均显著上升(p<0.05)。.qPCR结果进一步表明AlSP4基因主要存在于绿盲蝽唾液腺及中肠，揭示了消化系统是AlSP4基因的主要表达部位。蛋白表达并以类胰蛋白酶专一性底物Nα-benzoyl-l-arginine-p-nitroanilide(BAPNA)酶活生测分析，揭示了AlSP4基因在绿盲蝽体内主要编码一种类胰蛋白酶蛋白，其编码的体外重组蛋白具有明显的类胰蛋白酶活性。.通过RNAi干扰技术明确了AlSP4基因是绿盲蝽总类胰蛋白酶活性的重要组成基因；其基因表达被显著抑制(p<0.05)，并取食杂交/非杂交、Bt/亲本常规棉后的绿盲蝽体内总类胰蛋白酶活性均明显降低，同时绿盲蝽成虫寿命、单雌产卵量、孵化率等重要生命参数也都明显降低；当AlSP4基因表达被抑制，并取食不同棉花寄主后，相比取食亲本常规棉对照(非杂交棉泗棉3号，杂交棉苏棉9号)，取食Bt棉(非杂交棉国抗19号，杂交棉鄂杂棉10号)的绿盲蝽总类胰蛋白酶、成虫寿命、单雌产卵量、孵化率等参数下降的更多，揭示AlSP4是绿盲蝽适应Bt棉取食的重要基因，不管是杂交还是非杂交棉。此外，线性相关性分析表明，绿盲蝽总类胰蛋白酶活性与成虫寿命、单雌产卵量、孵化率等重要生命参数呈现显著正相关(p<0.05)。.AlSP4基因表达量被显著RNAi抑制后(p<0.05)，绿盲蝽AlVg、AlHSC70等基因表达量也随之明显下降；进一步研究表明AlVg基因、蛋白的表达量是影响绿盲蝽产卵量的重要参数，而AlHSC70基因与绿盲蝽抵抗杀虫剂及极端温度胁迫有关。因此，AlSP4基因、蛋白的表达不仅对于绿盲蝽总类胰蛋白酶活性、成虫寿命、单雌产卵量、孵化率等生理参数具有重要意义，也与绿盲蝽其它的生理功能、抗逆及生殖产卵等过程也有重要作用，表明AlSP4基因可作为Bt棉田绿盲蝽综合防治的潜在分子靶标。