黑曲霉抗菌活性组分分离及作用机制研究

Aspergillus niger is a fungus of lower eukaryotes. Aspergillus niger is a safe and excellent industrial fermentative strain, which was able to produce high levels of active enzyme.To develop and use the entomogenous fungus resource，the crude toxin from mycelia and metabolites of Asperillus niger will be yielded after multiple extractions with organic solvent. The antibacterial active constituents of A.niger metabolite components will be isolate and identify by using silica gel column chromatography，min layer chromatography, GC-MS technique and biological activity trackin．We will also investigate the action modes and activity of antibacterial constituents from Aspergillus niger xj metabolite components against Agrobacterium tumefaciens T-37, Ralstonia solanacearum and Pythium Pringsheim，and speculate its possible action mechanisms by discussing structural damage, and cell metabolic inhibition．The present study has some theoretical and practical significance for the further development and utilizing of this fungus and development of new environmentally friendly fungus bactericides.

黑曲霉(Aspergillus niger)是曲霉属黑曲霉群霉菌，为低等真核生物。黑曲霉是集安全和具有许多活性强大酶系等诸多优点于一身的优良工业发酵用菌种。本研究分离得到一株黑曲霉Aspergillus niger xj，其液体培养代谢物对根癌农杆菌、青枯雷尔氏菌、腐霉等常见农业病原菌有抑制作用。为充分开发利用这一真菌资源，利用有机溶剂多步萃取法，提取黑曲霉的抗菌成分，采用生物活性跟踪结合硅胶柱层析、薄层层析和气相色谱-质谱联用技术等色谱方法，对该菌株代谢物的抗菌活性成分进行分离、鉴定，测定评价代谢物活性成分对根癌农杆菌等常见病原菌的抗菌活性，探讨活性成分对细胞亚结构的破坏和抑制情况，细胞代谢关键环节的干扰情况，阐明其作用机理。本研究对于进一步开发和利用黑曲霉这一真菌资源，研究开发新型的环境友好微生物杀菌剂具有较大的理论和实践意义。

黑曲霉是集安全和具有许多活性强大酶系等诸多优点于一身的优良工业菌种，研究它对农业病害的抑菌成分及机理，对充分利用黑曲霉这一真菌资源及开发新型环境友好微生物杀菌剂具有重要意义。通过对项目研究内容的认真执行，达到了预期目标并获得以下成果：优化xj菌株高产活性成分的液体发酵条件，抑菌活性提高了85.9%；优化xj固体产孢条件，产孢量提高了52.1%。xj菌丝体浸膏分离获得7个段（S3-S9），xj孢子粉浸膏分离获得12个段（B1-B12），超临界萃取获得SE组分。活性追踪获得活性成分S3、S4、S5、S6、S7、B10及SE, 尤其B10、SE抑菌活性>90%。对活性成分进一步分离、纯化、鉴定，获得7个单体化合物：Ergosterol（R1）、5，5＇-Oxydimethylene-bis(2-furaldehyde)（R3）、Palmitic acid（R5）、Acetamide,2-chloro-N-(2,6- dimethylphenyl)-N-(1H-pyrazol-1-ylmethyl（R7），Nonacosane（R10）、Cholesta-3,5-dien-7-one（R12）、 Dimethyl 5-nitroisophthalate（R15），其中R3、R7、R12、R15首次从黑曲霉中分离。活性成分作用机制研究表明：B10可通过改变病原细菌细胞膜的渗透性、破坏细胞膜完整性、拉长细胞形态、引起细胞肿胀、畸形、引起细胞ROS氧大量积累、影响细胞6种碳源代谢、降低胞外糖类物质的吸收利用、减弱菌体磷代谢能力、影响细胞三羧酸循环关键酶SDH 和MDH的酶活、抑制胞内总蛋白的合成，从而抑制病原细菌的生长甚至导致菌体死亡。活性成分SE可通过改变病原真菌细胞膜的渗透性、引起细胞膜损伤、引起菌丝溶解、长度变短、出现褶皱、原生质凝结、严重变形等现象、引起真菌细胞核破碎、引起菌体内大量ROS累积、影响三羧酸循环关键酶SDH酶活，从而抑制病原真菌菌丝的生长、产孢结构的形成与发育，甚至导致死亡。.发表学术论文11篇（SCI 2篇，一级学报1篇，中文核心7篇）；申请中国发明专利8件（授权2件）；编制并发布实施贵州省地方标准1项；获“贵州省高等学校科学研究优秀成果奖”专利奖二等奖1项；获得贵州省优秀青年人才培养计划；2人职称及岗位获得晋升；6名研究生获得硕士学位。