链霉菌ZX01菌株抗TMV活性组分的分离纯化及作用机理研究

A new streptomycete strain ZX01 was selected from slurry samples collected from Kanas lake in Xinjiang China (restore No: CGMCC No. 4893; patent number: 201110301736.9). Systemically bioassay detection and field treatments indicated that the liquid broth of strain ZX01 possesses high inhibitory activity against tobacco virus, its inhibitory efficacy is noticeably higher than the antivirus pesticide we used. Further work need to be done for the application of this strain as an anti-tobacco virus agent. In this project, activity identification method will be used for isolation, purification, and structure detection of active secondary compounds of this strain. Use Nicotiana glutinosa and Nicotiana tabacum L. val: K326 and as the material, half-leave method, RT-PCR, and disease index survey were used to evaluate the protection and curative activity of compounds isolated, in order to identify its virulence and mechanisms. And then physiological and chemical detection,resistance related genes expression,concentration of TMV-CP and TMV-RNA,and Ultramicro pathology structure observation methods were used for the mechanism detection by the comparison of Nicotiana tabacum and TMV. This project is promising and hence merits further studies considering its progress in the intellectual proprietary and property rights for microbial antivirus agents and providing a new method for the integrate management of plant virus.

从采自新疆喀纳斯湖湿地泥样中筛选出了一株链霉菌新种- - ZX01（菌株保藏编号：CGMCC No. 4893；发明专利受理号：201110301736.9）。系统的室内生物测定和初步的田间小区药效试验结果表明，菌株发酵液中含有高活性的抗烟草病毒病物质，药效均明显高于标准对照药剂。本项目将在前期研究基础上，采用活性追踪法，对ZX01菌株发酵液中抗植物病毒活性物质进行系统分离、纯化和结构鉴定，进而以半叶枯斑法、实时荧光PCR法和病情指数调查相结合，综合评定分离出的高活性化合物对TMV病毒粒子的体外钝化、保护和治疗作用，以初步明确其毒力和作用方式；以普通烟和TMV病毒粒子为研究对象，从生理生化指标、抗病相关基因表达、病毒核酸、蛋白含量及寄主病理结构超微观察等方面探讨其抗病机理。项目研究结果将为创制具有自主知识产权的新型微生物源抗病毒剂奠定基础，为植物病毒病的综合治理提供新的途径。

植物病毒病发生普遍、防治困难，严重危害着农业生产，并在世界范围内造成了巨大经济损失。微生物是抗植物病毒剂研发的重要资源库，从微生物代谢产物中筛选与分离抗植物病毒活性物质一直是国内外学者们的研究热点。喀纳斯链霉菌ZX01是西北农林科技大学无公害农药研究服务中心从新疆喀纳斯湖畔树林土壤中分离得到的一株放线菌，经过前期试验表明ZX01菌株代谢物具有较好的抗植物病毒活性。基于此，本研究以链霉菌ZX01为供试菌株，主要对抗烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）活性成分进行分离、鉴定，并对其抗TMV作用机理进行初步探索，得出以下主要研究结果：.（1）采用萃取、吸附层析、离子交换层析等分离技术手段，并结合活性追踪，从喀纳斯链霉菌ZX01代谢物中分离得到了一种具有抗TMV活性的糖蛋白GP-1。该糖蛋白分子量约为8500 Da，多糖和蛋白含量分别为40.23%和54.36%；蛋白部分由15种氨基酸组成，其中酸性氨基酸Asp和Glu含量较高（15.15%和12.63%），碱性氨基酸Arg和Lys含量较低（0.62%和4.88%）；多糖部分由6种单糖组成，分别是甘露糖，木糖，阿拉伯糖、葡萄糖、氨基葡萄糖和半乳糖（0.38: 0.14:0.40:2.62:0.10:1.00）；GP-1中同时存在N-糖苷键和O-糖苷键；GP-1的二级结构包含20.10% β-折叠，21.70% β-转角和58.30%无规则卷曲，无α-螺旋存在。高温处理对GP-1的二级结构影响不大，但对其抗TMV活性有较大影响，60℃以下活性稳定，80℃以上活性逐渐丧失。经过质谱分析，GP-1是一个结构较为新颖的糖蛋白。.（2）采用活体和离体方法测定了糖蛋白GP-1的抗TMV活性，结果显示GP-1对TMV具有较强的保护效果，能够较好地阻止TMV侵染寄主植物。钝化试验与电镜试验共同表明GP-1对TMV粒子具有破坏效果，使得TMV丧失侵染能力。另外，GP-1还能抑制TMV外壳蛋白在寄主植物体内的积累，从而减轻发病症状。诱导抗性试验结果证明GP-1能够诱导寄主抗病性，并且随着诱导时间的延长，诱导产生的抗病性先增加后降低。GP-1处理后，烟草体内的防御酶SOD、PPO和PAL活性均急剧升高，而体内的MDA含量整体下降。.综上所述，链霉菌ZX01能够代谢产生一种特殊的糖蛋白，该糖蛋白展现出了较好的抗TMV活性