巨大芽孢杆菌活性成分分离及拮抗机制研究

Bacillus megatherium is the bio-control strains that has a wide antimicrobial spectrum of fungi and bacteria, but it is worth further research on the antibacterial components and action mechanism from Bacillus megatherium. Alternaria alternata, Phytophthora parasitica, Sclerotinia rolfsii sacc, Erwinia carotovora, Ralstonia solanacearum as indicator bacteria, the crude toxin from Bacillus megatherium will be yielded after multiple extractions with organic solvent. The antibacterial active components will be isolate and identify by using silica gel column chromatography，thin layer chromatography, HPLC, GC-MS, H1-NMR, C13-NMR technique and biological activity trackin. We will also investigate the action modes and activity of antibacterial constituents by discussing structural damage, cell metabolic inhibition and the destruction of cell protein. The study has some theoretical and practical significance for the further development of new environmentally friendly fungus bactericides and the highly active lead compounds.

巨大芽孢杆菌作为微生物菌肥及安全高效的工业产酶菌株已得到广泛应用，但作为一种抑菌谱较广的生防菌株，其抗菌活性成分及拮抗机制还不是很清楚，值得进一步深入研究。本研究以链格孢菌、疫霉菌、齐整小核菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、青枯雷尔氏菌等常见农业病原菌为指示菌，利用有机溶剂多步萃取法，提取巨大芽孢杆菌的活性成分；利用硅胶柱层析、制备薄层及HPLC等方法对萃取物进行分离得到抗菌单体化合物；利用红外光谱、质谱、核磁共振氢谱和碳谱等波谱数据对单体化合物的结构进行解析和鉴定；在细胞、亚细胞及分子水平上探讨化合物对病原菌形态、结构的影响，病原菌代谢关键环节的干扰情况及细胞蛋白的破坏情况，阐明其抑菌机理。为研究开发新型的环境友好微生物杀菌剂及发现高活性的先导化合物奠定基础。

巨大芽孢杆菌是常用于生物农药开发及生物防治的土壤优势菌种，研究它对农业病害的抑菌成分及机理，对充分利用巨大芽孢杆菌这一资源及开发新型环境友好微生物杀菌剂具有重要意义。通过对项目研究内容的认真执行，达到了预期目标并获得以下成果：优化巨大芽孢杆菌菌株高产活性成分的液体发酵条件，获得了最佳发酵条件：牛肉膏添加量4.6 g/L、氯化钠添加量3.0 g/L，接种量（V/V）：6%，装液量为50mL/250mL，温度：30℃，转速：150rpm，发酵时间：48h。抑菌活性提高了140.48％。巨大芽孢杆菌L2菌体共分分离、纯化、鉴定出4个单体化合物，分别是芥酸酰胺（J-1），二十二酸（J-2），苯乙酸（J-3,J-4），β-谷甾醇（J-5），均首次从巨大芽孢杆菌L2中分离获得。活性筛选研究表明：芥酸酰胺对三种细菌的抑菌活性都较弱，β-谷甾醇对供试菌抑菌率在25%左右，二十二烷酸仅对供试菌T-37、Q11-2有活性，抑菌率>65%，而苯乙酸对三种植物病原细菌的抑菌活性最强，抑菌率>75%，且高于活性组分J-2、J-3、J-4，首次证实并明确苯乙酸是巨大芽孢杆菌的主要活性物质。因此，对苯乙酸进行后续抑菌机制研究。经抑菌机制研究表明：苯乙酸可通过改变病原细菌细胞膜的渗透性、破坏细胞膜完整性、拉长细胞形态、引起部分细胞畸形、引起细胞ROS氧大量积累、减弱菌体磷代谢能力、降低细胞三羧酸循环关键酶SDH 和MDH的酶活、抑制胞内总蛋白的合成，从而抑制病原细菌的生长甚至导致菌体死亡；苯乙酸可通过改变病原真菌细胞膜的渗透性、引起细胞膜损伤、引起菌丝溶解、长度变短、出现褶皱、原生质凝结等现象、引起真菌细胞核破碎导致大量核酸、蛋白泄露、引起菌体内大量ROS累积、降低三羧酸循环关键酶SDH酶活，从而影响病原真菌菌丝的正常生长，抑制菌丝生长及产孢结构的形成与发育，最终导致死亡。.项目执行期间发表研究论文11篇，其中SCI3篇，EI3篇，一级学报2篇，中文核心期刊3篇；申请中国发明专利5件；授权2件，获得省级优秀青年科技人才1项，受聘中文核心期刊《中国酿造》、《生物学杂志》编委，受聘安顺市政府蔬菜发展顾问，获得贵州省优秀青年人才培养计划；1人职称及岗位获得晋升；7名研究生获得硕士学位。