基于化学衍生化和液相色谱-质谱联用技术测定生物基质中游离硫化氢的定量方法研究

Hydrogen sulphide exhibits complex and complicated biological effects, including those involved with cardiovascular functions, CNS functions, cytoprotection against reactive species, and cellular metabolism. In many pathophysiological conditions, administration of various formulations or precursors of hydrogen sulphide is of therapeutic benefit. Therefore, the research of hydrogen sulfide is currently a hot topic in the field of life science. However, due to the simple structure, easy to be oxidized, and biological matrix interferences, the quantitative study on various biological matrices is of great challenge. Until now it has still lack of the measure which is sensitive, reliable, and fit for determination of hydrogen sulfide in various biological matrices. In this study, we decide to use liquid chromatography - mass spectrometry combined with chemical derivatization method to establish a new quantitative measurement for free hydrogen sulfide in biological matrices, which can effectively compensate current determination methods. We will use the new method to study the effects of hydrogen sulfide on haematology in radiation model established in mice and myocardial inflammation in myocardial infarction model established in rat, respectively. We will, for the first time, draw a tissue-distribution graph of hydrogen sulfide for normal SD rat and CSE-knockout mice. Also we will study the hydrogen sulfide levels and dynamics in various tissues after administration of novel hydrogen sulfide donors （SPRC）. We believe that this study would provide strong supports to the basic and applied researches for hydrogen sulphide.

硫化氢具有广泛而复杂的生物学效应，它参与心血管功能、中枢神经系统功能，保护细胞免受活性分子损伤和影响细胞代谢等。在病理条件下，给予一定量的硫化物或者硫化氢供体分子有着积极的治疗意义。因此，对硫化氢的研究是目前生命科学领域的热点。然而，由于硫化氢结构简单、易被氧化，生物基质中干扰因素多，给生物样品中硫化氢定量研究带来极大挑战。目前，尚缺乏灵敏、可靠、适用于不同组织生物样品检测的定量方法。本研究拟首次建立采用液相色谱-质谱联用技术结合化学衍生化技术测定生物基质中游离硫化氢的新方法，从而克服和弥补目前方法学上的缺陷；拟研究硫化氢对放疗小鼠血液学和急性心肌梗死大鼠心肌炎症反应的影响；拟首次绘制正常SD大鼠和CSE基因敲除小鼠的主要组织中硫化氢浓度分布图；拟研究给予本课题组在研的硫化氢供体药物SPRC后大鼠各组织中硫化氢水平和浓度变化规律。本研究将为硫化氢的基础和应用研究提供有力支持。

硫化氢是第三个被发现的气体信号分子，具有广泛而复杂的生物学效应。对硫化氢的研究是当前生命科学领域的热点。然而，由于硫化氢结构过于简单、易被氧化，生物基质中以三种形态存在，干扰测试因素多，给生物样品中硫化氢定量研究带来极大挑战。目前，尚缺乏灵敏、可靠、适用于不同组织生物样品检测的定量分析方法。.在本基金的资助下，我们取得以下研究成果：.1）首次建立并确证了适用于不同生物基质中硫化氢浓度测定的液相色谱-串联质谱联用方法。该方法采用monobromobimane作为衍生试剂及合成的稳定性同位素硫36标记的sulfide dibimane (36S-SDB)作为内标。该方法被成功地运用于硫化氢在酶学、细胞、组织中的研究。我们运用所建立测量方法，研究了人血液中的硫化氢的浓度分布，确定硫化氢主要存在于红细胞中。进一步的研究表明，硫化氢与血红蛋白和血浆白蛋白的疏松可逆结合可能是硫化氢的一种新的体内存在形式。.2）我们研究了日间节律对小鼠血浆中硫化氢浓度的影响，研究表明小鼠血浆中硫化氢浓度和3-巯基丙酮酸硫转移酶（MPST）活性均存在日间波动，受H2O2调控的MPST活性变化是造成硫化氢浓度日间波动的可能原因。.3）我们研究了老年糖尿病小鼠体内硫化氢的浓度，观察到血浆、心脏和尿液中硫化氢浓度均低于正常小鼠。老年糖尿病小鼠心脏中硫化氢生成酶胱硫醚-γ -裂解酶和3-巯基丙酮酸硫基转移酶表达降低，胱硫醚-β-合成酶表达增加，提示老年糖尿病小鼠心肌中三种硫化氢生成酶的表达变化，使得硫化氢浓度降低，可能与糖尿病性心肌病的发病机制有关。.4）我们研究了硫化氢对炎症性贫血的治疗作用机制，发现AMPK能介导该作用，主要通过激活SOCS1介导的 JAK2降解。.5）我们通过研究硫化氢与动脉粥样斑块中内皮一氧化氮合酶（eNOS）和一氧化氮（NO）生成的联系，观察到患者动脉粥样斑块中硫化氢浓度和microRNA-455-3p（miR-455-3p）均有增加，然而血浆中硫化氢浓度却有减少。.6） 另外，本方法也成功用于研究两种合成硫化氢前体物质ZYZ-803和SPRC的生物学机制。